AM-AM-FS-Ac-05013 可可制品的石细胞与石细胞组计数

AMAMFSAc05013  可可制品  石细胞  石细胞组计数  定量法

AM-AM-FS-Ac-05013

可可制品的石细胞与石细胞组计数

1.仪器和试剂

1.1 仪器

(a)玻璃载片和盖片——75×38mm的玻璃载片，带有相距0.5mm的直线，几乎贯穿载片，平行于75mm边，并且从上到下划有直线。33×33×0.2mm璃璃盖片。

(b)勺——薄的(厚度约为0.01-0.02mm)不锈钢带约4.8mm宽，3mm处弯曲90°

(c)磁力搅拌器——带有长约16mm×直径约6mm的搅拌棒。搅拌捧在中心处带l3×8mm的隆起部分其将在底部明显凸起的1盎司软膏瓶(内容积:直径约36mm×高40mm)内旋转，产生涡流的混合和搅拌。

1.2 试剂

    Bellucci试剂——HOAc-H₂O-HNO₃(36+9+5)

2.试验过程

2.1.脱脂和研磨

见15-12C。【(a)不加糖的蛋——用差减法准确称取约2g混匀的样品15-1(a)（液蛋——取有代表性的一箱或几箱。将容器中的液蛋充分混匀并取出约300g(长柄药勺很好用)。密封在瓶中放入冰箱或用固态CO₂冷却。记录样品的气味和外观。）或(b)（冻蛋——取有代表性的一箱或几箱。检查其内容物的气味和外观 (用钻头钻透容器的中心，抽出钻头时记录下气味。这样内容物的情况可最好确定。如果不可能确保各个容器都这样，则样品可由从每个容器中取出的钻屑混合而成)。从不少于3个的远离部分，每部分均从容器边缘2—5cm开始，斜穿到对边尽可能接近底部取出钻屑。将钻屑密实地装入样品瓶，完全装满以防止样品局部脱水。将瓶子密封，放入冰箱或用固态CO₂冷冻。分析前，在低于50℃的水浴中温热样品并混匀。）放入盛有50—75ml H₂O的100ml容量瓶中，混匀并加大2.0ml Na₂SO₄溶液。边摇动边慢慢加入2.0ml 0.5M H₂SO₄。用H₂O稀释到刻度，混匀，过滤(18.5cm波纹滤纸)。把含有不超过4mg甘油的一份滤液转入300ml锥形瓶中，如果必要，用H₂O稀释到20ml。加2ml 10% NaOH溶液，煮沸并沸腾30s。稍冷却，加3滴溴甲酚紫，用0.5M H₂SO₄(用滴定管)中和，过量1—2滴。沸腾1min，冷却到室温，小心地用0.02M NaOH中和，滴定到亮紫色。把中性溶液定量转入100ml容量瓶，限定总体积少于50ml(在容量瓶上做出45ml体积的标记是有帮助的)如果必要，多加一点0.02M的NaOH保持淡而明确的紫色。按25-19F(b)继续进行，从加50ml KIO₄溶液开始，按25-19G(a)〖用甲酸滴定——（适于高碘酸盐氧化过程中不产生酸的情况）。从氧化后的混合物中取出50ml，放入滴定瓶中。加10滴丙二醇(约0.5ml)，混合均匀。用水将瓶壁上附着的试样冲洗下来。静置10min后，加3滴溴甲酚紫指示液，用NaOH溶液滴定到淡红紫色的终点。1ml 0.02M NaOH=1.842mg甘油。〗进行测定。氧化后，肯定存在过量的高碘酸，如果高碘酸试验是负的，应重新用更少量的一份样液进行测定。(b)加糖的蛋——用约2g样品，按(a)制备样品溶液。转移一份含甘油量不少于40mg的滤液入4.00ml烧杯，在蒸气浴上蒸发或者加水来调节体积为20ml。加0.5g CaO粉末，混合，在室温放置30min，不时摇匀。加25ml乙醇混合，用布氏漏斗和滤纸抽气过滤。用几份乙醇冲洗烧杯、漏斗和滤纸，尽可能把残留物转到滤纸上，但不要试图除去粘附在烧杯上的石灰盐层。把滤液定量转到原来的400ml烧杯，用几份H₂O冲洗烧杯。在蒸气浴上蒸发滤液到约10ml，用滤纸过滤，将滤液收集在300ml锥形中。用少量H₂O冲洗烧杯、漏斗和滤纸，限定滤液总量不超过25ml。往滤液中加入1ml 10%的NaOH并按 (a)从“加热到沸点并沸腾30s。”开始。】

2.2.测定

    上、下颠动盖着的盘子，混合已干燥 (在100℃下1h)的产物。进行重复测定。准确称量已提取和干燥过的物质0.500g，转移到150ml烧杯中。在20ml Bellucci试剂的一部分中缓缓搅拌至匀;用剩余的试剂淋洗烧杯壁和搅拌。轻轻地搅拌。将冷水注入100ml短颈圆底烧瓶中，加至颈部并放在烧杯上面；让棒静置于烧杯的斜嘴处。在石棉网上用小火将溶液加效至初沸。立即将火焰减至非常弱，使溶液轻微地沸腾10min，不断有小涡流，此时烧杯和烧瓶仍在一起。冷却大约5min。

    准确称量25×l00mm硼硅酸耐热玻璃(派热克斯)的无边缘的培养管，放在30ml烧杯中(带有支架)。用小部分水定量地将样品转移到培养管中，用橡胶淀帚擦洗烧杯和玻璃棒。在IEC320号防护罩或同类的防护罩内使用IEC571号弯曲橡胶垫，用国际临床离心机以全速离心3min以上。小心倾滗并除去上层清液 (可能有絮凝状物质存在)。加入水至管子的3/4处，塞上塞子，振荡直至残留物较好地分散。去掉塞子;按前面方法淋洗，离心和倾滗。

    向培养管内加入甘油水溶液(3+2)，加到管子和支架共增重20-0.03g为止。塞住，充分振荡至混合完全，立即转移到含小磁棒的102司软膏瓶中。塞上瓶塞，让其静置至小气泡消失(约5-10min)。

    准确地称量划有平行线的玻璃载片和盖玻璃片。在瓶内以不出现小气泡所允许的最大速度在磁力搅拌器上搅拌1min。停止搅拌。紧接着推动瓶子 (使磁棒贴于瓶子一侧壁)，使用小勺马上转移液滴(约0.04±0.01g)至己称重过的玻璃载片的中心——刻线上面。用勺轻轻敲击玻片数次，使尽可能多的移动液体。放上盖片，使一边搁在载片上并与底边平行。小心地降落盖片，直至接触到液体，然后让其落下。液体会渗出边缘，不要压盖玻片。称量准备好的玻璃载片，准确至0.lmg。瓶子塞上橡皮塞以防挥发。

    把载片放在复式显微镜上，此显微镜带有或不带聚光镜的上半部，并用透射日光型滤片和散射光。按照 (a)或 (b)的两种测定法中的每一种计数两个载玻片:

    (a)石细胞计数——用于可可、可可压缩饼、巧克力液或榨饼。在放大100倍下进行观测载片，并在放大200倍下计数石细胞。计数全部石细胞包括单一的、成组的、以及≥0.5个细胞的所有被破碎的石细胞。更小的碎片不再计数。

    (b)石细胞组计数——对于其它的巧克力制品。按照(a)中进行，仅计算包含2个石细胞以上的石细胞组。

2.3.石细胞的式样

    石细胞在大小、形状和一般外观上非常重要。有些非常明显而另一些则比较模糊。其大小约10-38μm不等;最大的是非常稀少的。偶而可以见到大至40μm的非常粗糙的带有厚的泡状外形约7μm宽外壁的石细胞。石细胞的形状是多边形，通常是不规则的，或许包含有曲面。对于发育良好的石细胞，外壁为2—3.5μm宽。对于不十分明显的石细胞，外壁比较窄而薄;这样的石细胞是不成熟的，或者是发育不良的。用显微镜观察时，在大量石细胞中容易见到少数几条近乎平行的薄壁或线。在外壁很薄的部位通常更加明显。石细胞通常是以组的形式存在，由两个以上的石细胞组成。

2.4.计算

    无论哪一种方法，以下面方程式之一所得的四个S值的平均值，即作为巧克力成分

中壳的百分含量:

    (a)石细胞数——S₁=84C/(17200M－G)

    (b)石细胞组数——S₂=84G/(1700M－G)

    其中W=样品的克数;L=稀释的样品克数;D=计数滴的克数;C=液滴中石细胞计数;M=液滴中干燥的脱脂样品的毫克数(=1000WD/L);S=巧克力成分中壳的百分含量;C=液滴中石细胞组的数;9340=在1mg干燥的脱脂的250目壳中石细胞数。

    [如:对0.5g样品稀释到20g,S₁=84C/(430000D－C)，S₂=84G/(42500D－G)。]

3.来源

AOAC 官方方法970.23（17版）