AM-AM-FS-Ac-19041 蜂蜜中糖的分离

AMAMFSAc19041  蜂蜜  糖  分离  果糖  葡萄糖  还原二糖(以麦芽糖计)  蔗糖  高柱或“葡聚糖” 木炭柱色谱法

AM-AM-FS-Ac-19041

蜂蜜中糖的分离

1.原理概要

先将蜂蜜样品吸附到木炭上，然后洗脱，依次流出的是单糖、二糖及多糖组分。二糖对葡萄糖及果糖测定的干扰则可消除。洗脱采用逐渐增大醇浓度的方法，然后测定各种单糖，蔗糖还原二糖（以麦芽糖计），经水解后测三糖及更高级糖总量。

2.试验过程

2.1.吸附桂的制备及标淮化

柱外径为22mm，长为370mm，在其上部由一个35/20标准锥度的球形接头与一个1L的球形容器连接。吸附剂由DarcoG-60木炭与快速助滤剂按1+1比例混合组成。塞一个玻棉塞，从下部湿润，加足量的干燥吸附剂到干燥的管中(23-26cm)，加真空系统，并轻敲柱的上部，吸附剂的体积可被压缩为17cm。从管中除去过量的木炭，并在上层加助滤剂，并轻轻压紧U-1.5cm)。用5OOml水及250ml 50%乙醇洗柱子，并在50%乙醇介质中平衡过夜。在用水洗脱，压力为62KPa的情况下柱流速应在5.5-8.0ml/min之间。流速太慢会大大延缓分析速度。

洗脱液中醇的含量应调整到适合于所使用木炭的保留能力。用250ml水洗净柱中的醇，定量地加含1g无水葡葡糖1Oml溶液到柱的上端，用吸气方式使其进入柱填料中:(但不要让柱干)，在柱上端加300ml水，停止吸气，加压(≤6gkPa)，用称量过的烧杯接5份洗脱液，每5Oml为一份。第一份5Oml应包括将样品引入柱中时吸出的1Oml，将各份样品在蒸汽浴上蒸发，在80-10O℃的真空箱中干燥，称重。

从柱的上端倒出多余的水，分别用5Oml 30%乙醇和250ml水洗柱子，再加含1g无水葡萄糖1Oml 1%的乙醇液，重复色层分离，用250ml 1%乙醇溶液按上述相同的方式洗脱。选择洗脱剂1，使其在15Oml内能全部洗出葡萄糖，若必要可用2%乙醇体系重复色层分离。

用250ml水和2Oml 5%乙醇分别洗柱子。在柱的上端加含1OOmg麦芽糖和1OOmg蔗糖1Oml 5%的乙醇液。按上述方法用250ml 5%的乙醇溶液洗脱，称量每5Oml溶液蒸干后固体的量，必要时可分别用7，8和9%的乙醇洗脱以找出洗脱剂2，洗脱剂2应能在2OOml内洗脱≤98%的二糖。最先选择的洗脱剂不应洗脱出二糖。对不同的木炭填料两种洗脱剂比较满意的组合方式为1%，7%；2%，8%和2%，9%，最后用100ml 50%的乙醇洗柱子，柱子保存在该溶剂系统中。

2.2.各组分的制备

    用250ml HD洗柱子，倒掉上端剩余的溶剂，加2Oml洗脱剂1，使其通过柱子，弃去流出液，在5Oml烧杯中把1g样品溶解于1Oml洗脱剂中。用长颈漏斗将样品转移至柱的上端，并使其进入柱的填料中。用15ml洗脱剂漂洗烧杯及漏斗，并加入到柱的上端。从引入样品开始收集所有的流出液到250ml容量瓶中。加250ml洗脱剂1，总共准确收集250ml(流分1，单糖)。倾倒出过量的溶剂，加入265-270ml洗脱剂2，用容量瓶收集250m1(流分2，二糖)。从上端倒出多余的洗脱剂，加110ml 5%的乙醇(洗脱剂3)，用容量瓶收集1OOml(流分3，三糖及三糖以上组分)。将各组分充分摇匀。

    柱子在用50%的乙醇饱和下，将出口封住后可长期保存。使用8次后废弃。

果糖

2.3.试剂

使用19-15A中的试剂及下述试剂:

19-15A：【(a)碳酸盐50试剂，5g KI——在2L烧杯中加约500ml水，溶解无水Na₂CO₃和四水酒石酸钾钠各25g。用漏斗在搅拌下加入75ml 100g/LCuSO₄·5H₂O溶液，漏斗的下端应没入烧杯的液面。加20g NaHCO₃，溶解后加5g KI。将此液转移至1L的容量瓶，加250ml的0.100 Mol/L KIO₃溶液(将3.567g KIO₃溶于1L水中配成)，稀释至刻度，用玻璃砂漏斗过滤，使用前陈化过夜。(b)碘化物-草酸盐溶液——溶解2.5g KI和2.5g K₂C₂O₄于水中；并稀释至100ml。每周新配制一次。(C)硫代硫酸钠标准溶液——0.0O25 Mol/L。每天由0.05 Mol/L的标准贮备液配制。(d)淀粉指示剂——将2.5g可溶性淀粉和约10mg的HgI₂在少量水中研磨，然后溶于约5OOml沸水中。(e)Na₂S₂O₃标准溶液——0.05M。】

(a)碘溶液——0.O5 Mol/L。将13.5g纯的碘溶解于含24g KI的200ml H₂O中，稀释到2L，不要标定。

(b)Na₂S0₄溶液——1%，将1g Na₂S0₄溶解在100ml H₂O中。每天新配制。

(c)溴甲酚绿溶液——将15Omg溴甲酚绿溶解在100ml H₂O中。

2.4.测定

    移取2Oml流分1到2OOml容量瓶中。用移液管加40ml O.O5M碘溶液；然后在剧烈混合的情况下3Os内加25ml O.1 Mol/LNaOH，并立即将容量瓶放进18±0.1℃的水浴中。在加碱后准确1Omin时加5ml 0.5 Mol/L H₂SO₄并将容量瓶从水浴中移出。用Na₂SO₄溶液刚好还原碘，在接近终点前加2滴淀粉(19-15A(d))。必要时可用稀的碘溶液返滴定。加5滴溴甲酚绿，用1 Mol/L NaOH正好中和溶液，然后使溶液对指示剂刚显酸性，稀释至刻度，用19-15B测其中5ml溶液的还原值。

    重复两次空白及样品的测定，空白值减去样品滴定值后计算果糖含量:

    %果糖=500((滴定值×O.1150)+0.0915)×1OO/mg样品

    葡萄糖测定中果糖的校正=f.c.=〔(滴定值×O.1150)+0.0915〕×40。括号内的值为5ml溶液中果糖的毫克数，该值的有效范围是0.5-1.75mg。

葡萄糖

2.5.试剂

    Na₂S₂0₃溶液——0.O025 Mol/L。由己标定的0.05 Mol/L贮备液制备。

2.6.测定

    移取2Oml流分1到2个250ml锥形瓶中。在空气流下将瓶子放在蒸汽浴上蒸干，加2Oml H₂O，用移液管加2Oml O.O5 Mol/L碘，缓慢地加25ml O.1 Mol/L NaOH，这一步与测果糖的步骤相同。然后立即放进18±0.1℃的水浴中，在加碱后正好1Omin时加5ml 1 Mol/L H₂S0₄，将瓶子从水浴锅上移开，用0.O025 Mol/L Na₂S₂O₄滴定，用淀粉溶液做指示剂。

    用水测2份空白，空白值减去样品滴定值，计算葡萄糖含量:

    %葡萄糖=56.275〔滴定值-0.0125×f.c.〕×1OO/mg样品

    式中f.c.为在果糖测定中确定的果糖校正值。方程式在2Oml溶液中葡萄糖含量为10-5mg的范围内有效。在葡萄糖存在下，1mg果糖需要 0.01215ml的0.O025 Mol/L Na₂S₂O₄(果糖范围为15-6Omg)。

还原二糖(以麦芽掂计)

4.7.测定

    移取5m1流分2到25-2OOmm试管中，按19-15B测还原值，只不过需将试管煮3Omin。可用15min的水空白值，按下式计算还原二糖(以麦芽糖计):

    %麦芽糖=50〔(滴定度×0.22)+0.075〕×1O0/样品mg数

    用于蔗糖测定中麦芽糖的校正因子=m.c.=麦芽糖滴定值×O.92。括号内数量为5ml溶液中麦芽糖的毫克数，该值的有效范围为0.15-3.8Omg麦芽糖。15min时麦芽糖还原值是最终还原值的92%。

蔗糖

2.8.测定

移取25ml流分2到5Oml容量瓶中，加5ml 6Mol/L HCl和5ml水。混匀，在60℃水浴中放置17min，冷却，以溴甲酚绿指示用5 Mol/L NaOH(103g/5OOml)中和(可用聚乙烯瓶装NaOH)。NaOH过量时可用1 Mol/L H₂S0₄调至指示剂的酸色。稀释至刻度，然后取5ml溶液用Shaffei-Somogyi法测定还原值，19-15B，从空白值减去该值，并按下表所做的标准曲线计算蔗糖的含量:

    5ml溶液中的蔗糖量                        0.O25 Mol/L Na₂S₂O₄

  (被氧化的量，mg)                          (需要量，ml)

    0.255                                     1.75

    0.502                                     3.95

    1.004                                     8.72

    1.260                                     11.98

    查标准曲线可得到S₁(S₁=相当于麦芽糖校正的蔗糖量)(H)，及S₂(S₂=相当于蔗糖滴定值的蔗糖量)。

%蔗糖=50(2S₂-S₁)×1O0/样品毫克数

高糖或“葡聚糖”

2.9.测定

    移取25ml流分3到50ml容量瓶中，加5ml 6 Mol/L HCl和5ml水，在沸水浴中煮沸45min，冷却，按测定蔗糖时的方法中和，稀释至刻度。测还原值，19-15B。从空白值中减去滴定值，按下表做的曲线查出葡萄糖的当量值。

    葡萄糖，mg                                   滴定值，ml

    0.05                                         0.20

0.10                                         0.60

0.25                                         1.85

0.50                                         4.00

1.00                                         8.50

  2.00                                         17.60

    %高糖=40(葡萄糖当量值)×1OO/mg样品

    注:对大多数准确的测定，Shaffer-Somogyi值变化必须在0.04ml之内。对高准确度的测定建议对所有的步骤进行检查，包括柱子，使用己知量的葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖及棉子糖(对其中的水分需校正)的标准混合物，在计算%果糖计算式中糖与Na₂S₂0₄体积ml之间的关系〔(滴定值×0.1150)十0.0915〕可通过分析已知量的葡萄糖和果糖混合物中果糖的量来确定。麦芽糖含量计算式中〔(滴定值×0.22)+0.075〕可通过分析已知量的麦芽糖溶液来确定。

柱效可以按19-44C通过用纸层析分离第1,2和3流分来检查。

3.来源

AOAC官方方法9.11（第17版）