AM-AM-FS-Ac-18070 乳脂肪中的乳酸

AMAMFSAc18070  乳脂肪  乳酸  分光光度法

AM-AM-FS-Ac-18070

乳脂肪中的乳酸

1.试剂

见18-12

    (a)乳酸钡标准溶液——将含有大约相当300mg游离乳酸的纯盐，如Li，Zn或Ca的乳酸盐溶于大约10mlH₂O中。将该溶液转入下图所示的萃取器中，加0.5mlH₂SO₄(1+1)，并将体积调到50ml。用乙醚萃取3h。把大约20ml水加到萃取瓶中，在蒸气浴上蒸发乙醚，并以酚酞为指示剂，用0.1N Ba(OH)₂小心滴定。中和的液体转入200ml容量瓶中，稀释到体积，混匀。把这个准确含有相当250mg游离乳酸的乳酸钡溶液移入500ml容量瓶，稀释到体积，混匀，此溶液为乳酸标准溶液(2ml溶液相当于1mg乳酸。用新制备的溶液制作标准曲线)。把20ml乳酸标准溶液移入100ml容量瓶;稀释至刻度，为稀乳酸标准溶液 (10ml相当于1mg乳酸)。

    (b)碳——将10g优级碳放入600ml烧杯中，加大约200ml H₂O和30ml 1N HCl，在蒸气浴上放20min，用通过棉花的空气不断搅动。在平底漏斗上过滤，尽可能抽干，用平头棒压实。把滤饼转入烧杯，加大约200mlH₂O，充分混合，再过滤。重复洗涤过滤两次，在100℃干燥。

    (c)氯化铁溶液——将2gFeCl₃·6H₂O溶于水，加5ml 1N HCl，稀释到200ml。

图  液体萃取器

2.试验过程

2.1.溶液的制备

(a)液体，全脂和脱脂乳——称50g放入100ml容量瓶。

(b)全脂和脱脂奶粉——称5g放入100ml烧杯，用粗搅棒加水研磨成糊状。用大约50ml H₂O将混合物转入100ml容量瓶。

(c)奶油和冰淇凌——称20g放入100ml容量瓶，加约50ml水。

(d)甜炼乳——称25g放入100ml烧杯，用大约50mlH₂O转入100ml容量瓶。

(e)淡炼乳——称25g放入100ml容量瓶，加入约50mlH₂O。

向混合物中加6ml 1N H₂SO₄混匀，不要用力搅拌。加5ml 20%的磷钨酸溶液(对奶油加1ml，对冰淇凌加2ml)，用H₂O稀释到体积，混合并通过折叠滤纸过滤。

(f)黄油——称20g放入离心瓶，加25mlH₂O在蒸气浴上加热。以酚酞为指示剂，用1N NaOH中和。冷却，加50ml乙醚，混匀，不要用力搅拌。加50ml石油醚，混匀，离心。用下端向上弯曲的虹吸管尽可能完全地除去乙醚层。每次用25ml乙醚反复萃取。把瓶子放在蒸气浴上除去大部分残留乙醚。将瓶中渣滓转入100ml容量瓶，加3ml 1N H₂SO₄混合。冷却，滴加20%磷钨酸溶液，使蛋白质沉淀，直到沉淀完全。稀释到体积，摇匀，用折叠滤纸过滤。

2.2.标准曲线的绘制

从滴定管中将下表左边栏中体积的标准溶液转到具有50和55ml刻度的容量瓶中。右边栏中给出经下述碳处理的各样品40ml滤液中乳酸的毫克数，此数将在分光光度计上读出。在各系列中必须包括用40ml H₂O代替乳酸溶液的空白。

向包括空白的各容量瓶中，各加入6.6ml 0.1N HCl和H₂O，至体积约为40ml。立刻加入200±1mg备好的碳，摇动，放在蒸气浴上10min，不断混合，冷却，在室温下用H₂O稀释到55ml刻度，立即用定量滤纸过滤，并把滤液倒回直到变清为止。

表  绘制标准曲线稀溶液的配制

将各40ml清滤液转入50ml涂黑的或包上黑纸的容量瓶中。由于40ml所用的滤液中只包含在碳处理中加入的4.8ml酸，再加1.2ml 0.1N HCl(容量瓶中总共需要6ml 0.1N HCl)。立即移取5ml FeCl₃溶液放入同一个容量瓶中，稀释到体积，混匀。将溶液倒入1cm石英池，在自记分光光度计上600nm处用基线校正，在350—600nm波长间测定最大吸光度A处的波长。如果没有自动记录的分光光度计，在365nm附近用手动扫描测定最大吸光度的波长。在此波长处，用空白溶液调零，测量所有标准溶液的吸光度(在光直射下，颜色会减弱，但由于己提供了保护措施，使其在数小时之内是固定不变)。以乳酸的毫克为横坐标)所得读数为纵坐标，绘制标准曲线(建议用大标度的作图纸，以便内插更准确)。

经常要检查最大A的波长和标准曲线，在使用新的一批碳或FeCl₃时，总是要进行。如果有差别，调整分光光度计或在新的最大A的波长处绘制新的标准曲线。

2.3.萃取

将50ml制备好的滤液和50ml H₂SO₄(1+1)放入萃取器内管，并连接到现有最长的球形冷凝器上，其出口管内径不小于13mm，以便使乙醚的反流减到最小。让水流过冷凝器达到最大冷凝效率。连接装有200ml乙醚的萃取瓶，并把率取瓶慢慢降低到预热的加热套或电炉上，防止乙醚过热。用直立的石棉网防止萃取器受到电炉的辐射热萃取全部乳酸。

    当萃取瓶中的乙醚保持迅速沸腾而且冷凝水足以使冷凝的乙醚以稳定的液流返回萃取器时，萃取3h可释放出全部乳酸。当通过冷凝器的水温高而萃取不能保持此速率时，连续萃取到相当7500ml乙醚通过溶液。对于给定的备组新条件所需要的时间T是从2个因数计算的：x是充满萃取器直到从侧面支管流出为止所需的乙醚体积，对于各仪器是常数;y是x体积的乙醚通过萃取瓶并充满萃取器所需要的最少时间。

    为测定x,将50ml H₂O和0.5ml H₂SO₄(1+1)放入萃取器。使萃取器保持垂直，小心地将乙醚通过刻度管灌入内管，直到侧管刚刚开始溢出。按开始各次测定的常规手续测定y。用秒表记录从冷凝器流出的第一滴乙醚落入内管到第一滴从满侧管溢出返回萃取瓶的时间间隔。7500ml通过仪器所需的时间T=7500y/x。只有当沸腾和冷凝速率在整个萃取周期中恒定时，才能计算T。

2.4.测定

    向装有乙醚萃取物的瓶中加20ml H₂O，在蒸气浴上逐出乙醚。在乙醚排出后，不要让瓶子继续在蒸气浴上。以酚酞为指示剂，用Ba(OH)₂饱和溶液中和。用乙醇洗入110ml容量瓶，直到体积大约为90ml。在蒸气浴上加热到近沸，冷却，用乙醇稀释到体积，用定量滤纸过滤。为了除去乙醇，将100ml滤液蒸发到大约10ml，加大约50ml水，再蒸发到10ml(或在蒸气浴上将100ml滤液蒸发至于)。

    从滴定管加6.6m10.1N的HCl，并用水把烧杯中的物质转入50—55ml容量瓶，直到体积大约为40ml。配制含6.6ml 0.1N HCl的空白液，用H₂O稀释到大约40ml。加200mg制备好的碳，立即混合，并在蒸气浴上保留10min并不断混匀。冷却，在室温用H₂O稀释到55ml刻度，用定量滤纸过滤，反复过滤直到滤液变清。

    把10ml滤液移入50ml黑色容量瓶(瓶中总共需有6ml 0.1N HCl;10ml经碳处理的滤液中含有1.2ml 0.1N HCl;因此再补加4.8ml酸)。由滴定管或移液管加5ml FeCl₃溶液，稀释到体积，混匀(发色后，稀释到颜色强度不再降低为止)。用溶液充满1cm石英池，在最大A的波长处，用试剂空白调零，从分光光度计上读数。

    在标准曲线上确定10ml等分溶液中存在的乳酸量。如果在10ml样品中乳酸量少于2mg；则应对剩余40ml滤液重复测定。40ml等分液含4.8ml 0.1N HCl，因此再加1.2ml酸。用mg/100g报告乳酸量。

    乙醚萃取液中的乳酸毫克数=Z=毫克读数×(55/10(或40))×(110/100)

    每100g样中乳酸毫克数=Z×(稀释样品的毫升数/等分萃取液的毫升数)×(100/样品克数)

3.来源

AOAC  官方方法945.50（第17版）