维普资讯 http://www.cqvip.com 第２６卷 第１期 海洋水产研究 Ｖｏ１．２６，ＮＯ．１ ２ ０ ０ ５ 年２月 ＭＡＲＩＮＥ ＦＩＳＨＥＲＩＥＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｆｅｂ．，２００５ 硝基苯肼衍生一高效液相色谱法 二 测定水产品中甲醛含量的研究 马敬军 ， 周德庆 柳淑芳 马洪明 （ 中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛２６６０７１） （ｚ中国海洋大学食品科学与工程系，青岛２６６００３） 摘要 通过水蒸汽蒸馏法分离提取水产品中的甲醛，采用二硝基苯肼衍生一高效液相法测定甲醛 含量，确定了有关测定的方法参数。该方法样品蒸馏液检出限为７．２０ ｔ￣ｇ／Ｌ，样品中的检出限为０・２０ ｍｇ／ｋｇ，回收率为９０．Ｏ０ ～１０４．４８ 。方法灵敏度高，专一性强，重复性好，可为水产品甲醛含量监 测提供灵敏、准确的分析方法。 关键词 高效液相色谱法 二硝基苯肼 甲醛 水产品 中图分类号ＴＳ２５４．７ 文献识别码Ａ 文章编号 １０００—７０７５（２００５）０１—００２８—０４ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ＨＰＬＣ ｗｉｔｈ ｄｉｎｉｔｒ０ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ＭＡ Ｊｉｎｇ—ｊｕｎ ， ＺＨＯＵ Ｄｅ—ｑｉｎｇ ＬＩＵ Ｓｈｕ—ｆａｎｇ ＭＡ Ｈｏｎｇ—ｍｉｎｇ （ Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｅａ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０７１） （。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６００３） ＡＢＳＴＲＣＴＳ Ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ（ＨＰＬＣ）ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｓｔｅａｍ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅ—ｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅ— ｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｗａｓ ７．２０／￣ｇ／Ｌ ｉｎ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ａｎｄ ０．２０ ｍｇ／ｋｇ ｉｎ ｓａｍｐｌｅｓ， ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９０．００ ～１０４．４８ ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｓ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ｓｔｒｏｎｇ ｓｐｅ— ｃｉａｌｉｔｙ，ａｎｄ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ ＨＰＬＣ Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ Ａｑｕａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ 甲醛又称蚁醛，具有强烈刺激性气味。对人的神经系统、肺、肝脏均可产生损害，甚至致癌（王移兰 ２０００）。因此，国家早已明令禁止在食品中添加甲醛。为了加强对水发水产品的质量监管，迫切需要建立甲醛 的检测方法。文献报道的甲醛测定方法，如乙酰丙酮比色法（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａ１． １９９７；胡文兰 ２００２；周光宇等 ２００３）、变色酸比色法（Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａ ｅｔ ａ１． １９９３；李文明２０００）、高效液相色谱法（Ｉｂｅｎ １９９５；黄雪娟等 ２０００）、气谱法（Ａｎｄｒａｗｅｓ １９８４；隋雪燕等２００２）等方法，主要适用于空气、纺织品、化工原料、水等中游离甲 国家自然科学基金项目（３０４７１３５０）和青岛市自然科学基金项目（０４—２一ＪＺ一８５）共同资助 ＊通讯作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｄｑ＠ｙｓｆｒｉ．ａｃ．ｃｎ，Ｔｅｌ：（０５３２）５８３６３４８ 收稿日期：２００４—０９—１３；接受日期：２００４—１１－２２ 作者简介：马敬军（１９７６一），男，硕士，主要从事水产品加工、水产品质量安全研究。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第１期 马敬军等：二硝基苯肼衍生一高效液相色谱法测定水产品中甲醛含量的研究 ２９ 醛的测定。水产品中甲醛的测定方法多为定性检测，缺乏对主要测定技术包括样品的前处理方法、回收率、精 确度深入和系统的研究，制约了水产品中甲醛监测工作。本文采用水蒸气蒸馏将水产品中游离和可逆结合的 甲醛蒸馏出，然后经２，４一二硝基苯肼衍生化后，利用高效液相色谱测定甲醛含量，对其检测方法进行了研究， 建立了水产品中甲醛的二硝基苯肼衍生液相测定方法。 １材料与方法 １．１实验材料 实验所用的材料均为我国市场的水产品包括鲜活水产品、水发水产品、干制水产品等。取肌肉等可食部 分，样品总量不少于５０ ｇ，其中鱼类去头、去鳞，取背部肌肉和腹部肌肉；虾去头、去壳、去肠腺后取肉；贝类去壳 后取肉；蟹类去壳、去性腺和肝脏后取肉。 将所取样品用组织捣碎机捣碎，混合均匀后根据样品量称取１０ ｇ，置于２５０ ｍｌ圆底烧瓶中，加入２Ｏ ｍｌ蒸 馏水，用玻璃棒搅拌混匀，浸泡３０ ｍｉｎ后加１Ｏ ｍｌ１Ｏ 磷酸溶液，立即通入水蒸汽蒸馏。蒸馏液接收管的下口 事先插入盛有２Ｏ ｍｌ蒸馏水且置于冰浴的接收装置中。蒸馏过程中应根据不同样品的特性适当调整水蒸气 量，以防止形成的泡沫外溢干扰实验结果。准确收集蒸馏液至２００ ｍｌ，同时做空白蒸馏。 １．２仪器和试剂 １．２．１ 仪器 高效液相色谱（ＨＰ１１００）带紫外检测器（ＤＡＤ）；色谱柱：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ—Ｃ ４．６×２５０ ｉｌｌｍ，５ １３３．；５ ｍｌ具塞 比色管；恒温水浴锅；旋涡混合器；高速离心机；水蒸汽蒸馏装置包括１ ０００ ｍｌ圆底烧瓶，２５０ ｍｌ圆底烧瓶， ＫＤＭ型调温电热套；２００ ｍｌ容量瓶；１０ ｍｌ纳氏比色管等。 １．２．２试剂 磷酸溶液（１：９）；甲醛标准贮备溶液：吸取０．３ ｍｌ含量为３６ ～３８ 甲醛溶液于１ＯＯ ｍｌ容量瓶中，加水 稀释至刻度，冷藏保存（此溶液可保存１４ ｄ），其浓度用碘量法标定；甲醛标准溶液（２０ ｇ／ｍ１）：根据甲醛标准贮 备液的浓度，精密吸取适量于１００ ｍｌ容量瓶中，用水定容至刻度，混匀备用（现用现配）；甲醇（色谱纯）：经过 滤、脱气后使用；二氯甲烷（分析纯）；２，４一二硝基苯肼溶液：称取１００ ｍｇ ２，４一二硝基苯肼溶解于２４ ｍｌ浓盐酸 中，加水定容至１００ ｍｌ；无水硫酸钠（分析纯）：经马福炉６５０℃灼烧４ ｈ，冷却后使用。 １．３二硝基苯肼衍生化步骤 取蒸馏液０．１～１．０ ｍｌ，置于５ ｍｌ具塞比色管中，加蒸馏水至１．０ ｍｌ，分别加入０．２ ｍｌ ２，４－二硝基苯肼溶液， 置６０。Ｃ水浴１５ ｍｉｎ，然后在流水中快速冷却，加入２ ｍｌ二氯甲烷，用旋涡 昆合器震荡萃取１ ｒａｉｎ，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 ２ ｍｉｎ，取上清液再用１ ｍｌ二氯甲烷萃取两次，合并３次萃取的下层黄色溶液，将萃取液经无水硫酸钠柱脱水，６０ ℃水浴蒸干，冷却。取１．０ ｍｌ色谱纯甲醇溶解残渣，经０．２２／，ｍ滤膜过滤后做ＨＰＬＣ分析用。 １．４ 曲线的绘制与样品测定 分别取２０／，ｇ／ｍｌ的甲醛应用液０．００、０．１０、０．２５、０．５、０．７５、１．０ ｍ１（相当于０、２、５、１０、１５、２０ ｇ甲 醛）于５ ｍｌ具塞比色管中，加蒸馏水至１．０ ｍｌ。经衍生化处理后取２０ １进样。根据保留时间定性（５．１ ｍｉｎ 为目的峰），峰面积定量，每个浓度重复做两次，取平均值，以峰面积与甲醛浓度，绘制标准曲线。取样品处理液 ２Ｏ ｌ注入ＨＰＬＣ测得积分面积后从标准曲线查出相应的浓度，计算甲醛含量。 ２结果与讨论 ２．１样品液相色谱条件 本实验通过最大吸收波长扫描实验证明波长在３５５ ｎｍ时吸收峰最大，鉴于在该波长下，杂质峰对主峰的 维普资讯 http://www.cqvip.com ３０ 海洋水产研究 第２６卷 干扰较大，而在３３８ ｎｍ时杂质对其干扰少，因此将检测波长选定为３３８ ｎｍ。由于改变流动相配比会改变衍生 剂与甲醛衍生物的分离度，实验发现甲醇：７￣（６０：４０）为流动相，流速为０．５ ｍｌ／ｍｉｎ时，分离效果最好。柱温 ４０．０℃；液相色谱进样体积为５ ｔｔｌ。 ２．２ 吸收峰及其对应物质的确定 实验中发现样品液衍生化后通过ＨＰＬＣ后两吸收峰保留时间分别为３．０ ｍｉｎ左右和５．１ ｍｉｎ左右，如图 １所示。经进一步实验，甲醛可使２，４一二硝基苯肼全部衍生化生成２，４一二硝基苯腙，此时做高效液相出现的吸 收峰相对应的物质为２，４一二硝基苯腙，保留时间为５．１ ｍｉｎ左右。因此可知５．１ ｍｉｎ左右时出现的吸收峰为 衍生物测定特征峰。 ２．３衍生化条件 ２．３．１ ２，４一二硝基苯肼的用量 衍生剂用量过大（５．０ ｇ／Ｉ ）时，２，４一二硝基苯肼峰过 大，而２，４一二硝基苯腙峰太小。当衍生剂量过小（０．１ ｇ／Ｌ） 时，衍生化不彻底。采用１．０ ｇ／Ｌ浓度时，能使衍生化完全 而且２，４一二硝基苯腙峰为２，４一二硝基苯肼峰的两倍左右， 分离效果较好，可满足测定要求。 ２．３．２衍生化时间、萃取次数 图１ 甲醛高效液相法吸收峰图谱 为弄清衍生过程水浴时间并使其衍生化彻底，固定其 Ｆｉｇ．１ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｂｙ ＨＰＬＣ 他条件（６０℃水浴，衍生剂用量为１．０ ｇ／Ｌ），进行了１５、 ２０、２５、３０、３５、４０ ｍｉｎ的反应时间的实验。结果表明，在１５ ｍｉｎ后峰面积趋于稳定，说明已衍生化完全，因 此把衍生化时间定在１５ ｍｉｎ。萃取实验，先用２ ｍｌ二氯甲烷萃取１次，再用１ ｍｌ二氯甲烷萃取１次，可将萃 取层萃取至无色，为萃取完全可再增加１次萃取。 ２．４标准曲线及相关系数 通过配制的甲醛标准溶液按实验步骤进行，在最佳实验条件下，做峰面积（Ｘ）与甲醛含量（ｙ）的关系曲线， 得到其线性方程为ｙ一０．００４ ３Ｘ一１．０３７ ８（ｒ一０．９９９ ４）。 ２．５精密度 按照实验方法精密度实验采用３个浓度的标准溶液５、１０、２０ ｐｔｇ／ｍｌ，每个浓度测定６次，计算其精密度， 得到不同浓度甲醛溶液相对标准偏差，结果见表１，分别为２．５６ 、３．６１ 和１．８０ ，都小于４．０ 。 表１精密度实验（ 一６） Ｔａｂｌｅ １ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｂｙ ＨＰＬＣ（ 一６） ２．６ 回收率 高效液相法回收率通过加标实验，即向样品蒸馏液中添加甲醛标准溶液２、５、１０、２０ ｇ进行柱前衍生， 维普资讯 http://www.cqvip.com 第１期 马敬军等：二硝基苯肼衍生一高效液相色谱法测定水产品中甲醛含量的研究 ３１ 通过液相色谱后，计算得到回收率为９０．００％￣１０４．４８％。结果见表２。 表２ 甲醛离效液谱法的回收率实验 Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ２．７衍生物的稳定性 用浓度为１０、２０ ｇ／ｍｌ的标准溶液按文中１．３操作步骤衍生、萃取后，在冷藏保存０、２４、４８、７２、９６ ｈ后 进行测定，测定结果表明，衍生物７２ ｈ内仍保持稳定。 ２．８检出限 以信噪￣ｇ（Ｓ／Ｎ）为３条件下相对应的浓度定为检出限，计算得到该方法的检出限为７．２０／．ｔｇ／Ｌ，相当于样 品中甲醛的检出限为０．２０ ｒｎｇ／ｋｇ。 ２．９样品测定 用本法对１８份水产品（Ｔｋ发水产品、虾类、鳗鲡、鳕鱼、文蛤等）进行测定，测得１７份样品甲醛含量范围为 ０．４５～１９２．９４ ｍｇ／ｋｇ，１份样品甲醛含量低于０．２０ ｍｇ／ｋｇ。 ３ 结论 利用水蒸汽蒸馏法分离出甲醛后，通过柱前衍生一高效液相色谱法测定水产品中甲醛含量，具有很好的线 性关系，重复性好，专一性强，是水产品包括鲜活水产品、水发水产品、干制水产品中甲醛痕量、灵敏、准确的分 析方法。 参 考 文 献 王移兰．２０００．甲醛对人体健康的危害．职业卫生，４Ｏ～４１ 李文明．２０００．３１５种水发食品中甲醛定性监测结果分析．河南预防医学杂志，１１（５）：２８６ 胡文兰．２００２．乙酰丙酮法测定水发产品中的甲醛．浙江预防医学，１４（５）．８０ 周光宇，胡敏予，黄忆明．２００３．乙酰丙酮法检测米粉中甲醛含量的应用及分析．实用预防医学。１０（２）：２５６～２５７ 黄雪娟，张大年．２０００．用高效液相色谱测定雨水中的甲醛．环境化学，１９（６）：５６６～５７１ 隋雪燕，李雪梅，张宗雁，宋元，陈磊，张宏志．ＺＯＯ２．纺织品中游离甲醛的气相色谱分析．分析化学，３０（１１）：１ ３３３～１ ３３６ Ａｎｄｒａｗｅｓ，Ｆ．Ｆ．１ ９８４．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｅｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ｐｕｒｅ ａｉｒ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｈｅｌｉｕｍ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ． ２２（１１）：５０６～５０８ Ｇｏｌｄ，Ｔ．１３．，Ｂｕｉｃｅ，Ｒ．Ｇ．Ｊｒ．，Ｌｏｄｄｅｒ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ ＩＮｇｅｎｉｓ，Ｇ．Ａ．１９９７．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｉｎ ｈａｒｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｃａｐｓｕｌｅｓ ｂｙ ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４（８）：１ ０４６～１ ０５０ Ｉｂｅｎ，Ｅ．１３．１９９５．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ｆｒｏｚｅｎ ｆｉｓｈ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｆｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｇｅｌ—ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．３２０：１５５～１６４ Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａ，Ｉ．，ａｎｄ Ｊｕｒｋｉｅｗｉｃｚ，Ｍ．１９９３．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｖｅｒｉｎｇｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏ— ｍｏｔｒｏｐｉｃ ａｃｉｄ．ＲＯＣＺ．Ｐａｎｓｔｗ．Ｚａｋ１．Ｈｉｇ．４４（２３）：１７５～１７９
