T-SPOT实验操作流程-2017

样本要求：

1、 肝素抗凝采血管采集全血样本（无需空腹） 2、 血量要求：

① 一般患者5-8ml ② 免疫力低下患者8-10ml ③ 2岁以下儿童2-3ml

3、 室温（18-25℃）保存与运输，不得冷冻与冷藏 4、 近期有输血或做过PET-CT的患者，建议两周后再送检 5、 运输过程中防止颠簸，避免样本溶血，溶血样本不能进行检测 6、 送检时间：

① 无延长试剂（T-Cell Xtend）：4小时内送检，8小时内完成细胞分离 ② 有延长试剂（T-Cell Xtend）：4小时内送检，32小时内完成细胞分离

准备工作

1、配套试剂无菌确认：

1) RPMI-10培养基 2) AIM-V培养基 3) 淋巴细胞分离液

正常为清澈、透明、无漏液（出现浑浊，有异物，漏液情况的，应停止使用） 2、设备准备：

1) 使用消毒液擦拭生物安全柜并紫外灭菌30min以上

2) 确认培养箱运行在37℃、5％CO₂浓度条件，并确保水盘中有足够的水，防止培养过

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程中干板

3) 使用消毒液擦拭所需移液器，确保移液器表面及腔体无菌 3、耗材准备：

1) 无菌15ml锥底离心管（3-4支/人份） 2) 无菌吸管（2-3支/人份）

3) 无菌加样头（10µl、100µl、1ml若干） 4) 无菌1.5ml离心管（1-2支/人份）

5) 无菌50ml离心管（1-2支）（用于实验中分装10培养基，降低污染风险） 6) 实验中会用到的其他耗材及工具等

4、加延长试剂（T-Cell Xtend）（在实验开始前，已超过8小时的样本需加延长试剂） 1) 按25µl/ml的量加入延长试剂（5ml样本需加入125µl延长试剂） 2) 盖上管盖，轻轻颠倒混匀8-10次（充分混匀并避免溶血） 3) 室温(18-25°C)静置10-25 min后开始实验

实验操作流程及注意事项 第一天（要求全程在II级生物安全柜中操作）

一、PBMCs（外周血单个核细胞）提取

1、将全血样本转移至15ml离心管中，加10培养基稀释至10ml （实验中10培养基需用无菌50ml离心管分装使用，防污染） 2、在另一15ml离心管中加入3-4ml淋巴细胞分离液

3、将稀释好的血液样本缓慢加入到分离液上层（缓慢加入，不要破坏分离液液面） 4、使用18℃，1000g条件离心22min（建议使用缓慢降速档，以获取更好的分离效果） 5、分离后，使用无菌吸管将分离得到的PBMCs层吸至另一无菌15ml离心管中（不能吸到底层的血细胞）

二、 细胞洗涤：

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1、 将收集得到的PBMCs细胞悬液加10培养基至10ml，颠倒混匀 2、 使用18℃，600g条件离心7min

3、 弃上清，使用移液器将沉淀细胞吹打混匀，加10培养基至10ml，颠倒混匀

（细胞吹打需使用移液器充分吹打混匀，才能达到细胞洗涤目的） 4、 使用18℃，350g条件离心7min 5、 弃上清（上清液需要尽量弃彻底）

6、 加入500µl的AIM-V培养基，使用移液器充分吹打混匀

（实验中AIM-V培养基需用无菌15ml离心管分装使用，防污染）

三、 细胞计数

细胞计数仪计数：

吸取小于100μl的细胞悬液至1.5ml离心管，上机计数，记录“淋巴细胞+单核细胞和值 ”

（如上样量需要大于100μl，可用10培养基稀释1倍，再上机计数，计数结果相应乘以2） 显微镜计数：

1、先加入40µl 10培养基至1.5ml离心管底部，再加入10µl细胞悬液充分混匀，进行5倍稀释

2、取5倍稀释后的细胞悬液10µl充池血球计数板，计数四个白细胞计数区域之一（四个区域的任一个）的白细胞数，记录计数结果

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计数区域示例图

四、 加样（取相应样本数的板条，编号并标注各抗原孔位置）

板条示例图

1、加抗原

1) 所有对应样本的空白对照孔中（N）加入50µl AIM-V培养基 2) 所有对应样本的抗原A孔中加入50µl抗原A 3) 所有对应样本的抗原B孔中加入50µl抗原B

4) 所有对应样本的阳性质控对照孔中（P）加入50µl阳性质控品 2、加样（不同的计数方法，参照其对应的加样表） 细胞计数仪计数

参照“附件一：细胞计数仪计数，加样表”，在对应编号的板孔中加入相应的细胞悬液

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量及AIM-V培养基的量（既保证每个板孔中有25万个PBMCs，又保证150µl的总体系，防止培养干板）

（加样顺序为N到P，悬空加，防止阳性质控品污染其他板孔） 显微镜计数

参照“附件二：显微镜计数，加样表”，在对应编号的板孔中加入相应的细胞悬液量及AIM-V培养基的量（既保证每个板孔中有25万个PBMCs，又保证150µl的总体系，防止培养干板）

（加样顺序为N到P，悬空加，防止阳性质控品污染其他板孔） 五、 过夜培养：

将加样完成的培养板盖好后，放入37℃、5%CO2浓度培养箱中培养16-20h （要求培养箱中有足够的湿度，避免干板，请确保培养箱水盘中有足够的水）

第二天(洗板、显色、结果判读)

一、 配制酶标二抗工作液（须当天新鲜配制）

1、 取（n+1）×200µl的1×PBS至无菌离心管中（n表示样本数）

（1×PBS要求：1、不能含有表面活性剂 2、PH值严格要求在7.0-7.5之间），以下1×PBS要求相同）

2、 取（n+1）µl酶标二抗原液至上一步的1×PBS中，并充分混匀 二、 第一次洗板（洗去细胞及非特异结合）：

从培养箱取出培养板，弃细胞液，用1×PBS洗板四次

每次每孔加入200µl的1×PBS，放置30秒，倒弃，使用滤纸拍干 三、 加酶标二抗孵育：

每孔加入50µl新鲜配制的酶标二抗工作液，在2-8℃条件下孵育1h。 四、 第二次洗板：

取出培养板，倒弃酶标二抗，用1×PBS洗板四次

每次每孔加入200µl的1×PBS，放置30秒，倒弃，使用滤纸拍干

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五、 显色：

每孔加入50µl底物显色液，室温避光显色7min 六、 终止显色：

1、蒸馏水或自来水洗板6-10次，终止显色，并使用滤纸拍干 2、重复前一步操作，共进行两次洗涤并拍干 七、烘干

使用55℃的烘箱干燥5-10分钟，读取斑点数判读结果

结果判读：

根据抗原A孔或抗原B孔的斑点数判读结果： 1、 当空白对照孔斑点数为0～5个时：

(抗原A孔或抗原B孔斑点数) 减去（空白对照孔斑点数)≥6，为“阳性” 2、 当空白对照孔斑点数为6～10个时：

(抗原A孔或抗原B孔斑点数) ≥2×（空白对照孔斑点数)，为“阳性” 3、如不符合上述标准，且阳性质控对照孔正常时检测结果为“阴性” 结果解释：

阴性结果：提示该样本中未检测出针对结核分枝杆菌特异的效应T淋巴细胞 阳性结果：提示该样本中检测出针对结核分枝杆菌特异的效应T淋巴细胞

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附件一：细胞计数仪计数，加样表

WBC浓度 (109/L) 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 WBC悬液 (μl) 125 119 114 109 104 100 96 93 86 83 81 78 76 74 71 69 68 66 63 61 60 58 57 56 53 52 51 AIM-V (μl) 0 0 0 0 0 0 4 7 11 14 17 19 22 24 26 29 31 32 34 36 38 39 40 42 43 44 46 47 48 49 WBC浓度 (109/L) 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 WBC悬液 (μl) 50 49 48 47 46 45 45 44 43 42 42 41 40 40 39 38 38 37 37 36 36 35 35 34 34 33 33 32 32 32 AIM-V (μl) 50 51 52 53 55 55 56 57 58 58 59 60 60 61 62 62 63 63 65 65 66 66 67 67 68 68 68 WBC浓度 (109/L) 8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 10 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7 10.8 10.9 WBC悬液 (μl) 31 31 30 30 30 29 29 29 28 28 28 27 27 27 27 26 26 26 26 25 25 25 25 24 24 24 24 23 23 23 AIM-V (μl) 69 69 70 70 70 71 71 71 72 72 72 73 73 73 73 74 74 74 74 75 75 75 75 76 76 76 76 77 77 77 注：当细胞计数值大于表中的最大值时，请将15ml离心管里面的，500μl细胞悬液用AIM-V培养基进行适量的稀释，重新计数

操作者对实验熟练以后，在细胞第二次洗涤结束后，可目测细胞数量的多与少，酌情多加或少加一定量的AIM-V培养基，使细胞计数值在“2-10”之间

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附件二：显微镜计数，加样表

细胞数 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

注：当细胞计数值大于表中的最大值时，请将15ml离心管里面的，500μl细胞悬液用AIM-V培养基进行适量的稀释，重新计数

操作者对实验熟练以后，在细胞第二次洗涤结束后，可目测细胞数量的多与少，酌情多加或少加一定量的AIM-V培养基，使细胞计数值在“50-205”个之间

样本量 167 125 100 83 71 63 56 50 45 42 38 36 33 31 29 28 26 25 AIM_V 0 0 0 17 29 38 44 50 55 58 62 67 69 71 72 74 75 细胞数 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145 155 165 175 185 195 205 样本量 143 111 91 77 67 59 53 48 43 40 37 34 32 30 29 27 26 24 AIM_V 0 0 9 23 33 41 47 52 57 60 63 66 68 70 71 73 74 76 8