实验八 大分子物质的水解及营养元素对微生物生长的影响

杨明轩生物111 1102040128

一、实验目的

1、通过了解不同细菌对不同的生物大分子及含氮化合物的分解利用情况，认识微生物代谢类型多样性。 2、了解营养元素对微生物生长的影响。 3、学习平板接种法（点接）及穿刺接种法。

二、实验原理

某些微生物能产生胞外酶，将大分子的淀粉、蛋自质和脂肪等分解为小分子物质，然后再被微生物吸收利用。不同的微生物因具有不同的代谢酶系而表现出不同的代谢类型，即当它们作用于相同的底物时可以产生不同的终产物。这些可以作为微生物鉴定和分类的依据。本实验通过微生物对碳水化合物（如淀粉）、含氮化合物（蛋白质）和含磷有机物（卵磷脂）的水解，证明微生物对于这些大分子有机化合物的水解作用。淀粉的水解是由于微生物分泌淀粉酶作用的结果，可用碘液来检测；微生物产生并分泌磷酸酯酶，可水解卵磷脂为脂肪和甘油；蛋白质中的含硫氨基酸被分解产生硫化氢，遇到培养基中的铁盐或铅盐，就形成黑色的硫化铁或硫化铅。

微生物的生长发育需要一定的营养物质和环境条件，只有全面满足以上要求时，微生物才能进行正常的生命活动。影响微生物生长、繁殖的主要营养元素主要包括碳、氢、氧、氮、磷、硫等，个别微生物还需要某些维生素和微量元素。本实验通过将黑曲霉接种于缺乏不同营养元素的培养基中，观察它的生长情况，确知几种营养元素对微生物生长的作用。

三、实验材料

1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、黑曲霉（Aspergillusniger）； 2、培养基：淀粉培养基、LB培养基；

3、试剂：20%蔗糖溶液、1.5%铵溶液、0.5%KH2PO4、混合液（1.2%MgSO4、0.05%NaCl、0.005%FeSO4

等量混合）、蒸馏水、生理盐水，以上试剂灭菌备用；

5、仪器：无菌培养皿、100ml无菌三角瓶、无菌吸管（5ml、10ml）、移液器、接种用具。

四、实验方法

（1）淀粉水解实验

1、制备平板：将冷却至45℃左右的淀粉培养基倒入无菌培养皿中，每皿约15ml，共2皿。凝固后在平板背后划十字状的线，将其分成四部分，分别标记E. coli、S. aureus、B. subtilis、P. vulgaris。

2、接种：在平板相应的位置上分别点接E. coli、S. aureus、B. subtilis、P. vulgaris，37℃下导致培养2天。 3、观察结果：打开皿盖，加入卢哥式染液，使碘液均匀铺满整个平板。观察是否出现透明圈。 （2）含磷有机物（卵磷脂）的水解实验

1、制备平板：将鸡蛋用酒精棉球擦净，剥离一小块蛋壳，放出蛋清，用去掉针头的无菌注射器抽取蛋黄3~5ml，与10ml生理盐水混合，充分混匀，取6ml蛋黄液与融化好的150ml细菌培养基（45℃左右）混合均匀，倒平板，凝固后在平板背后划十字状的线，将其分成四部分，分别标记E. coli、S. aureus、B. subtilis、P. vulgaris。

2、接种：平板相应的位置上分别点接E. coli、S. aureus、B. subtilis、P. vulgaris，37℃下导致培养2天。 3、观察结果：观察平板接种周围是否出现透明圈。

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（3）营养元素对微生物生长的影响

1、取4个无菌培养瓶，分别写好标记：完全、缺碳、缺氮、缺磷，按照下表加入各种培养基成分。

表1 不同营养元素对微生物生长的影响

培养基成分 蔗糖/ml NH4NO3/ml KH2PO4/ml 混合液/ml 蒸馏水/ml

完全 6 3 1 1 4

缺碳 0 3 1 1 10

缺氮 6 0 1 1 7

缺磷 6 3 0 1 5

2、按无菌操作的要求，接入黑曲霉（A. niger），摇匀，置28℃温箱培养一周后观察结果。根据菌膜厚薄、孢子生长情况来判断菌丝生长发育的好坏，分析实验结果。

五、实验结果

（1）微生物对大分子化合物的水解

将实验八、实验九两次实验结果填入下表2，并分析各种微生物的产酶特点。

表2 大分子物质的水解实验结果

菌名 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 普通变形杆菌

淀粉水解 － ＋ － －

卵磷脂水解

＋ － － －

H2S产生 － － － ＋

分析：结果表明，枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，金黄色葡萄球菌能产生磷酸酯酶，而普通变形杆菌则能够产生H2S使培养基变黑。由于这三种酶都是在细胞外起作用的，因此均为胞外酶。 （2）营养元素对微生物生长的影响

将实验结果填入下表3，并分析。

表3 营养元素对微生物生长的影响实验结果

生长状况

完全 ＋＋＋＋

缺碳 －

缺氮 ＋

缺磷 ＋＋

注：生长情况用“＋”表示。

分析：黑曲霉在完全培养基上生长良好，有大量菌丝体存在；而在缺氮、缺磷培养基中生长不良，仅见到一层菌膜；在缺碳培养基上未见黑曲霉生长。

六、思考题

1、微生物对大分子化合物的水解实验能否证明微生物中存在的这三种酶均为胞外酶，为什么？ 答：该实验能够证明这三种酶都是胞外酶。三种培养基中的淀粉、卵磷脂和蛋白质是不能够直接进入细菌细胞的，而淀粉培养基和卵磷脂培养基上的透明圈、半固体培养基因H2S变黑的位置都是在细胞之外，这就表明三种酶在细胞之外就已经将三种大分子水解。因此，可以说明三种酶是胞外酶。

2、从营养元素对微生物生长的影响实验结果中可以得出什么结论？

答：结果说明微生物的生长需要各种营养元素，缺少了其中一种都会影响其生长。而就C、N、P三种元素来说，C对微生物的生长影响最大，缺少C元素时微生物完全不能生长。

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