酶联免疫分析技术在兽药残留检测中的应用

渊武汉生物工程学院食品工程系袁武汉

430415冤

摘要院介绍了酶联免疫吸附分析方法的原理、类型以及在兽药残留检测中的关键技术环节和国内外应用现状，讨论了酶联免疫吸附分析技术应用于兽药残留检测所存在的问题和发展前景。关键词院酶联免疫分析；兽药残留；应用中图分类号院S859.84

文献标识码院B

文章编号院1007原273X渊圆园员猿冤1园-0059-03

兽药残留不仅直接对人体产生急慢性毒性作法尧酶标抗体直接竞争抑制法尧酶标抗体间接竞争抑用袁引起细菌耐药性的增加袁还通过环境和食物链的制法遥在兽药残留检测中一般采用间接法测抗体效作用对人体健康造成潜在危害遥加强兽药管理和兽药价袁评价抗体质量袁用竞争法测定样品中兽药残留残留分析是控制兽药残留的重要手段遥兽药残留的分量袁其中酶标抗体间接竞争抑制法有商品化的酶标析方法一般有免疫分析法尧气相色谱法尧高效液相色二抗袁无需自己制备袁而被广泛采用遥

谱法和毛细管电泳法等遥其中袁免疫分析法具有高度的选择性和灵敏度尧分析2ELISA应用的关键环节技术发展前景咱1暂遥酶联免疫过吸程附简分化析等(Enzyme-Linked优点袁有很大的

2.1免疫抗原的合成

ImmunosorbentAssay袁ELISA)是将免疫技术与现代

抗原是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或测试手段相结合而建立的一种超微量的测定技术袁致敏淋巴细胞袁并能与这些产物在体内或体外发生目前已广泛应用于临床医学尧兽医学尧生物学等领

特异性反应的物质遥抗原的基本能力是免疫原性和域遥ELISA检测技术具有操作简单尧前处理简化尧检反应原性遥免疫原性又称为抗原性袁是指能够刺激机测快速尧准确尧敏感尧成本低尧容量大袁并可同时进行体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力遥反应原性大批量样品检测等优点袁这种学科交叉技术正逐渐是指能与由它刺激所产生的抗体或致敏淋巴细胞发成为兽药残留检测的一个热点遥

生特异性反应遥具备免疫原性和反应原性两种能力1兽药残留ELISA检测技术的概述的物质称为完全抗原遥只具有反应原性而没有免疫原性的物质袁称为半抗原遥半抗原没有免疫原性袁不会引起免疫反应遥但在某些特殊情况下袁如果半抗原发展起来的ELISA是在袁是荧把光抗免疫和原抗体放免疫射免疫反应的特分析的异基性和础上酶和大分子蛋白质结合以后袁就获得了免疫原性而变的高效催化作用有机结合起来的一种检测技术袁采成完全抗原袁也就可以刺激免疫系统产生抗体和效用现代光学分析仪器进行光度测定遥测定时用固相应细胞遥

载体吸附抗体渊抗原冤袁加待测抗原渊抗体冤袁再与相应抗原的免疫原性与分子量直接相关遥一般分子的酶标记抗体渊抗原冤进行抗原抗体的特异免疫反量越大尧分子结构越复杂则免疫原性越强遥兽药大多应是小分子物质渊袁属于半抗原袁因此通常要与分子量较大的载体渊一般为蛋白质冤偶联袁形成兽药要要要载体成抗袁生有原成色冤的抗产复体物合渊袁待物抗测袁原最冤抗后-待原再测渊抗与抗体该原冤酶渊的的抗定底体量物发生冤-酶标记抗体

与有色反产应物袁生量蛋白结合物免疫原袁即形成完全抗原遥相同大小的分成正比袁因此可根据吸光值计算抗原或抗体的量袁不子袁如果化学组成尧分子结构和空间构象不同袁其免仅可以疫原性也有差异遥一般来说袁分子结构和空间构象愈复杂的物质免疫原性愈强遥所以袁免疫半抗原的结构建立ELISA定性的方法方分袁其法析分类是用而且至酶可以今标进无记行统抗定一原量的尧分标准半析抗遥

袁原或常用的方抗体而法是否合理袁关系到能否制备稳定并有良好免疫原性有院双抗体夹心法测抗原尧酶标抗原直接竞争抑制

的人工免疫原袁也是兽药残留ELISA方法建立的重

收稿日期院圆园员3原09原14

作者简介院张泽英渊1980原冤袁女袁四川泸州人袁讲师袁硕士袁主要从事食品分析与检测工作遥

.com.cn. All Rights Reserved.60

湖北畜牧兽医2013年

要环节遥理想的免疫半抗原一方面应尽量具备与待隔臂冶冤袁目前大多数学者认为袁较适宜的间隔臂长度测物有类似的化学特征袁另一方面与载体连接后应为4耀6个碳链长度渊0.5耀0.8nm冤袁能较好的突出与尽量保证该特征结构最大程度地被免疫活性细胞识载体结合后抗原分子表面上具有特征立体结构和免别和结合袁以制备出具有预期选择性和亲和性的抗疫活性的化学基团即抗原决定簇遥间隔臂应是不会体遥有些待测兽药残留物可直接作为免疫半抗原袁与改变半抗原的电子分布的吸电子基团或杂环袁应为载体偶联袁但对多数不具备活性基团的兽药可进行非极性袁除供偶联的活性基团外不应有其他高免疫

衍生化制备或由原料合成袁也可用其他代谢及降解活性的结构袁以减少抗体对间隔臂的识别咱3暂产物作为免疫半抗原遥

2.3兽药抗体的制备

遥完全抗原的制备是将免疫半抗原活化后袁在偶一般可采用两种途径产生抗体院一是多克隆抗体联剂作用下与载体蛋白偶联遥常用的载体蛋白质有技术袁二是杂交瘤单克隆抗体技术遥多克隆抗体可用(KLH)牛血清蛋白(BSA)尧卵清蛋白(OVA)尧钥孔血蓝蛋白

兽药-载体蛋白结合物直接免疫兔子等动物袁从被免疫的动物血清中获得袁这种抗体不均一袁来源间断袁有多聚赖尧人氨血酸清渊PLL蛋白冤遥(HAS)目前尧袁结用的核最杆多菌的是毒素蛋BSA白袁(TT)因为尧较大的批间差别袁但用于免疫分析效果良好袁技术成其物化性质稳定尧不易变性尧价廉易得袁而且赖氨酸熟袁目前绝大多数兽药免疫分析仍采用多克隆抗体遥含量高袁自由氨基多袁在不同的pH和离子强度下均单有较大的溶解度袁在含有有机溶剂渊如吡啶尧N袁N-二甲基甲酰胺冤情况下均可和免疫半抗原进行偶联袁且

90克种兽药的年代隆抗开始体应用于兽药残留分析的研究是从20世纪

单克的隆袁近抗体20袁年的发展其中一些国已内应用于兽药外已制备出残十留几检在偶联后仍保持可溶状态咱2暂测技术中咱4暂有时为了提高抗体效价遥

和特异性袁通常需要在复杂袁但其特遥异单性克高隆袁抗交体叉技术反应虽然少袁可生大产批成量本生高产袁技术

袁成半抗原与载体间引入一定长度的间隔分子渊又称野间

为兽药残留ELISA检测技术的发展趋势遥

表1常见抗微生物类兽药的ELISA分析

兽药类别

检测药物检测样本

检测限//滋g/kg参考文献

新霉素肌肉尧肝脏尧肾脏尧蛋尧奶

卡拉霉素

蛋尧奶5.7~29.3氨基糖甙类

庆大霉素尧小诺霉素

肌肉1.26链霉素牛奶5072

磺胺甲基嘧啶

牛奶尧蜂蜜尧猪尿

鱼肉10磺胺类

磺胺甲基嘧啶袁磺胺二甲氧嘧啶袁磺胺嘧啶磺胺塞唑袁磺胺嘧啶袁磺胺吡啶袁新诺明

猪尿尧牛奶<1000.05

11磺胺嘧啶尧磺胺甲嘧啶

猪饲料0.2和-

0.041213环丙沙星尧达氟沙星袁依诺沙星袁恩氟沙星等

鱼尧虾喹诺酮类恩氟沙星尧环丙沙星

猪肉牛奶9.4臆0.214环丙沙星0.095和0.21516氯霉素类

氯霉素牛奶甲砜霉素

猪饲料--1718茁-内酰胺类

羟氨苄青霉素袁氨苄青霉素袁苄青霉素G袁苯氧

牛奶甲基青霉素袁乙氧萘青霉素等

牛奶

19青霉噻唑酸0.0300.7~9.3

依0.002

20

多西环素

鸡肉尧鸡肝尧鸡蛋多西环素袁四环素袁氯四环素袁土霉素等

牛肉尧牛奶0.1421四环素类

多西环素鸡肉尧鸡肝1.5~6.9

依0.02多西环素

牛奶

臆0.07

2252324大环内酯类泰乐菌素尧替米考星

鸡肉尧肝脏尧牛奶尧蜂蜜尧蛋

5.1~13.825.com.cn. All Rights Reserved.第10期

张泽英院酶联免疫分析技术在兽药残留检测中的应用

61

2.4样品的前处理

酶联免疫吸附分析具有高选择性尧高灵敏度袁一般仅需要简单提取袁可使用稀释样品或提取液的方式减少基质干扰遥样品提取溶剂需考虑其对免疫反应和酶活性的影响袁一般认为袁免疫分析的样品溶液不能含有非水溶性溶剂袁因为其形成的非均相介质可干扰待测物自由扩散或干扰与抗体结合遥但也有人认为袁反应介质中适量水溶性有机溶剂存在袁如甲醇尧丙酮尧二甲亚砜等袁不仅可以简化操作袁而且能增加脂溶性兽药在介质中溶解袁降低其在实验器皿表面的吸附损失和破坏样品基质的亲脂性胶束咱5暂遥

3ELISA检测技术在兽药残留分析中的应用随着小分子化合物免疫分析技术的发展袁目前几乎所有常见的兽药残留都已建立了ELISA检测方法袁检测样本多样袁主要有动物组织渊包括肌肉尧肝脏尧肾脏等冤尧蛋尧乳尧蜂蜜尧饲料尧尿液尧毛发等遥兽药种类繁多袁按用途分类主要包括院抗生素类尧合成抗菌素类尧抗寄生虫药尧杀虫剂和促生长剂袁抗生素和合成抗菌素合称抗微生物药物袁是最主要的兽药残

留药物袁冤约国占内60%外有关咱6-10抗暂2013年遥微表生物1列类出兽药了近残3留年ELISA渊2010至测方法的检测样本尧检测限和兽药种类等情况遥检

4问题和展望兽药残留的酶联免疫分析技术经过几十年的发展袁已经取得了可喜进展袁但由于兽药种类繁多尧结构复杂尧检测样本各异袁该技术的研究和开发应用仍存在很多尚待解决的问题袁如人工免疫抗原的合成尧免疫反应的特异性和抗体的选择性尧方法的标准化

等咱11-19暂断完善遥袁但尤免疫其是制分析备技术更加的特自异身的优势单克和方隆抗法体或上的功不能更加完备的重组单链抗体袁以及免疫传感器技术和芯片技术的日益完善袁必将在兽药残留快速检测领域发挥愈来愈重要的作用遥

参考文献院

咱1暂李

物医学娜袁进祁展克袁宗2006.免疫袁27(2):13-16.

分析法在兽药残留分析中的应用咱J暂.动

咱2暂陈学新出建版.社免疫学袁1998技术袁157-158.

在植物科学中的应用咱M暂.北京:中国农业大

咱3暂谢

的研晶究袁咱叶J暂健强.畜牧兽医袁余

杂志华袁袁等2011.动袁物性30(1):28-30.

食品中兽药人工抗原合成

咱4暂蔡动勤物医学仁袁曾进振展灵袁袁2002杨桂袁23(2):香.兽药25-28.

残留免疫检测技术应用进展咱J暂.

咱5暂李报俊,1998锁,渊钱18传冤:411-415.

苑.兽药残留免疫分析及其进展咱J暂.中国兽医学

咱6暂SOLOMUNB,BILANDZICN,VARENINAI,etal.Validation

screeningofanenzyme-linkedimmunosorbentassayforqualitative

咱J暂.FoodAdditofneomycinContaminPartmuscle,AChemliver,Analkidney,ControleggsExpoandmilk咱7暂Assess.2011GAL'VIDIS袁28(1):11-18.

Risk

enzyme-linkedIA,BURKINMA.Monoclonalantibodybased

CHENkanamycininfoodstuffimmunosorbent咱J暂.BioorgassayKhim.2010,36(6):7-796.

foraminoglycosideantibiotic

咱8暂detectionY,ofLIgentamicinX,HEL,andetmicronomicinal.Immunoassaysinswineformuscletherapid

JAOACInt.2010,93(1):335-342.

咱J暂.

咱9暂WUbasedJELISAX,ZHANGandcolloidalSE,ZHOUgold-basedXP.immunochromatographic

Monoclonalantibody-

咱10暂urineassayYANG咱J暂for.T,JstreptomycinresidueRENZhejiangX,UnivLIY,ScietBdetectional.袁2010,11(1):52-60.

inmilkandswine

monoclonal

antibodyDevelopmentofasensitive

sulfamethazineincow-basedmilk,ELISA

honey,for

andthe

swinedetection

urine咱J暂of

Hybridoma(Larchmt)袁2010,29(5):403-407..咱11暂CHA'FERal.-PERICA'SC,咱12暂fishFastLIUsamplesscreeningMAQUIEIRAA,PUCHADESR,et

咱J暂.AnalimmunoassayBioanalChemofsulfonamides袁010,396(2):in911-921.

commercialmonoclonal

N,HANantibody

Z,LUL,and

etal.its

Developmentbased

competitive

ofanewindirect

rabbit

enzyme-linkedimmunosorbentassay咱13暂JIME'NEZsulfonamidesenzyme-linkedV,咱JADRIAN暂.JSciFoodimmunosorbentJ,GUITERASAgric.2013,forassayforJ,et93(3):rapiddetectingal.Validation667-673.detectionofsulfonamides

ofan

in咱14暂7531.

feedresources咱J暂.JAgricFoodChem袁2010,58(13):7526-competitive

TAOX,CHENM,JIANGH,etal.Chemiluminescence

fluoroquinoloneindirect

residuesenzyme

infishandimmunoassay

shrimpbasedfor

on20

single-chainvariablefragment咱J暂.AnalBioanalChem.2013,

a咱15暂ZHANG405(23):anH7477-7484.

enrofloxacinindirectT,competitiveJIANGJQ,2011袁12(11):and884-1.

ciprofloxacinELISAWANG咱forZL,etal.Developmentof

J暂.simultaneousJZhejiangUnivdetectionSciBof袁

咱16暂HUANGrabbitofanmonoclonalB,YINY,indirectcompetitiveantibodiesLUL,etELISAforal.ciprofloxacinPreparationforresiduesandofhigh-affinity

indevelopmentZhejiangUnivSciB.2010,11(10):812-818.milk咱J暂.J咱17暂chloramphenicol

WANGL,ZHANGresidues

Y,GAOin

X,milk

etby

al.Determinationenzyme-linked

of

immunosorbentassay:improvementbybiotin-streptavidin-咱18暂amplifiedsystem咱J暂.JAgricFoodChem.2010,58(6):3265-3270.

DevelopmentLUOPJ,JIANGthedeterminationofanWX,CHENX,etal.Technicalnote:

ofenzymeflorfenicol-linkedimmunosorbentassayforfeed咱J暂.JAnimSci袁2011,(11):andthiamphenicol3612-3616.

inswine咱19暂JIAOhaptenSandN,WANGproductionP,ZHAOofgenericGX,etmonoclonalal.Synthesisantibodyofnovel

immunoassayofpenicillinsresiduesinmilk咱J暂.for

HealthB袁2013,48(6):486-494.

JEnvironSci.com.cn. All Rights Reserved.