荧光分析法在纳米生物分析中应用研究进展

2007年第1期 Journal of Shenzhen Polytechnic No.1, 2007

荧光分析法在纳米生物分析中应用研究进展

崔淑芬

（深圳职业技术学院 应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055）

摘 要：对荧光分析法在纳米生物分析中的应用进行了评述，重点讨论了纳米荧光探针、纳米生物传感器等纳米生物分析材料器件的特性及其在生物分析中的应用。对发光量子点、复合型荧光纳米粒子和具有光学活性的金属纳米粒子作为生物分子的标记探针取得的成果进行了总结。介绍了光纤纳米荧光生物传感器、胞内生物传感器和光纤纳米免疫生物传感器的现状及发展。

关键词：荧光分析法；纳米生物分析；纳米探针；纳米生物传感器

中图分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：1672-0318（2007）01-0021-06

荧光分析法作为一种分析方法，早在19世纪60年代就已出现。该方法具有许多突出优点：①选择性好；②具有多种测定参数（如荧光寿命、荧光各向异性、荧光量子产率、荧光激发波长、发射波长等）；③灵敏度高；④具有多种检测技术和方法（如同步荧光、导数荧光、荧光偏振、荧光动力学分析法、三维荧光光谱法及相分辨、时间分辨荧光分析法等）。故可以依据实际测定条件的不同加以选择，因而具有适用性强、选择性好、线性范围较宽的特点，是一种简便实用的分析技术[1]。

生命科学的飞速发展对分析化学提出了大量新的课题，目前集中在多肽、蛋白质、核酸等生物大分子分析，生物药物分析，超痕量、超微量生物活性物质分析，甚至微生物分析等。因此，生物分析已成为现代分析化学发展的最重要的前沿领域之一。为了适应这种形势的要求，众多分析化学工作者正在不断努力开发着新的方法和技术。纳米尺度上的生物分析化学就是其中的一个重要代表[2,3]。纳米生物分析材料和器件及其在生物分析中的应用是当今国际分析科学领域的研究前沿及发展方向之一，是各国关注重视的研究热点[3]。在生物医学及生命科学中应用最多的是分子光谱分析方法。其中由于荧光光谱的灵敏度高、 收稿日期：2006-09-25

选择性好，因此对分子荧光方面的研究更是十分活跃。纳米生物分析和荧光法的结合最为紧密。本文对荧光分析法在纳米生物分析中的应用研究进展进行了综述。

1 纳米荧光探针

荧光探针作为研究生物大分子（如：核酸、蛋白质）的有力工具，在20世纪90年代取得了长足的进展，新的靶扩增技术（PCR）已日臻完善，发光标记探针也已经与放射性同位素标记具有同等重要的地位，而且已应用于DNA杂交研究、疾病诊断和食品微生物检测等方面。荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色，DNA电泳，核酸分子杂交，定量PCR技术以及DNA测序上都有着广泛的应用前景[4,5]。目前，应用最为普遍的荧光探针是有机染料，在大多数情况下，由于它们的激发光谱都较窄，所以很难同时激发多种组分，而其荧光特征谱又较宽，并且分布不对称，这又给区分不同探针分子的荧光带来困难，因此要同时检测多种组分较为困难。有机染料最严重的缺陷还是光化学稳定性差，光漂白与光解使每个染料探针能够发出的荧光光子平均数量不可能太多，光解产物又往往会对生物体产生杀伤作用。利用纳米粒子作为生物

项目来源：深圳市科技计划项目（05KJba053）

作者简介：崔淑芬（1969-），女，辽宁抚顺人，副教授，博士，主要从事分析化学研究。

22 深圳职业技术学院学报 第6卷 荧光探针就能较好的解决这些问题。与传统的荧光探针相比，纳米晶体的激发光谱宽，且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可调，即不同大小的纳米晶体能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光，并且光化学稳定性高，不易光解。

目前有3种类型的纳米粒子可作为荧光标记：①发光量子点；②复合型荧光纳米粒子；③具有光学活性的金属纳米粒子。

1.1 发光量子点的基本特性及其在生物分析中

的应用

量子点（Quantum Dot，简称QD）也称半导体纳米粒子或半导体纳米晶，是一种由Ⅱ-VI和Ⅲ-V族元素组成的纳米颗粒[6]。目前研究较多的是CdX（X=S，Se，Te）。单独的量子点颗粒容易受到杂质和晶格缺陷的影响，荧光量子产率很低，但是当以其为核心，用另一种半导体材料覆盖，形成核壳结构（core-shell）后，就可有效消除非辐射弛豫途径，防止光化学褪色，对吸光系数和荧光发射均有很强的增加。相对于传统的荧光染料，核壳式量子点作为荧光探针具有许多优点[6]：①激发光谱和发射光谱可以通过改变纳米粒子的尺寸和组分来进行控制，并具有较大的斯托克位移和狭窄对称的荧光发射谱峰。填补了普通荧光分子在近红外光谱范围内品种少的不足，有利于活体生物材料的检测，激发光谱波长范围宽，可使用同一激发光源同时进行多通道的检测。②量子点为多电子体系，在可见和紫外光区的吸光系数很高，荧光效率远高于单个分子。光化学稳定性高，可以经受反复多次激发，不易发生荧光漂白；发光寿命长，可达ms级。因此能够使用激光诱导荧光，并可采取时间分辨技术来检测信号。半导体纳米粒子虽然具有较高的荧光量子产率和较好的荧光寿命，但是，由于其水溶性差，无法与生物大分子作用。必须对无机纳米粒子进行功能化修饰，使纳米晶体可溶并能同生物分子作用，才能实现对生物大分子的检测[7]。

发光量子点可用于蛋白质标记分析。Alivisators研究小组[7]制备了CdSe-ZnS的核-壳结构的纳米晶体，并以SiO2涂层，然后再在表面经不同基团修饰后，能控制与生物样品的相互作

用。用此方法合成的纳米晶体可以溶于水或缓冲溶液，量子产率高且稳定，成功地用于鼠组织细胞的标记。Nie等[8]将CdSe-ZnS以疏基乙酸修饰后，使得纳米粒子不仅具有水溶性，同时能与生物分子相结合，实现了纳米粒子与转铁蛋白通过酰氨键的结合。研究表明，这些纳米大小的生物结合体的荧光强度比有机染料，如罗丹明高20倍，光漂白速率低100倍，荧光光谱宽度只是罗丹明光谱宽的1/3，而且仍具有水溶性和生物相容性。有量子点标记的转铁蛋白能够被细胞膜上的受体离子通道识别并进入细胞内部，在结合或传输过程中没有明显干扰。这表明利用这种方法可以研究活细胞中给体－受体之间的反应或分子交换。Goldman等[9]分别用510，555，590，610nm四种不同波长的CdSe/ZnS量子点标记抗体，采用“三明治”免疫分析方式，同时在一个混合物样品中进行了葡萄球菌、肠毒素B等4种蛋白质毒素的检测[9]。

发光量子点在核酸检测方面也有许多应用。量子点修饰的DNA分子，可作为低聚核苷酸的标记荧光探针，特异性地与其互补配对的低聚核苷酸杂交，用作荧光原位杂交的标记物。标记量子点的DNA分子与其互补的DNA配对后，荧光光谱会发生变化，量子点排列方式的改变是导致它们荧光变化的原因[10]。Han等[11]把发出不同光的量子点组装在聚合物微球中，通过杂交反应并根据微球中量子点的种类和荧光强度的比例进行编码，可为每种DNA序列提供相应的荧光信息，其准确度可达到99.99%。Patolsky等人则利用CdSe/ZnS量子点与有机荧光团的共振能量转移来监测DNA复制的动力学[12]。

1.2 复合型荧光纳米粒子及其在生物分析中的应用

复合型纳米粒子是指荧光分子或发光分子通过其它材料的包裹或连接形成几百个甚至上千个发光粒子构成的纳米粒子，如包裹着若干个染料分子的荧光纳米球，包含着稀土配合物的纳米粒子[13]。这种包裹着发光分子的纳米球有如下作用：①使更多的发光分子连接在生物分子上，起到信号放大作用；②可克服外界环境对发光试剂的影响（如猝灭作用等），增加发光试剂的稳定性；③可减少荧光分子的泄露，降低其对活体细胞的

第1期 崔淑芬：荧光分析法在纳米生物分析中应用研究进展 23 毒副作用。相对于传统的单个发光分子标记方法，用多个发光分子组成的纳米颗粒作标记物是一种“集成”的先进方法，这种方法与现有的有关标记方法相结合，可能会使所有的分析方法的灵敏度得到提升，有可能成为未来标记物的主流。

复合型纳米粒子目前主要包括荧光纳米球乳液和复合荧光二氧化硅纳米粒子。与单个的染料分子不同，在纳米荧光乳液微球（Nanometer-sized Fluorescent Latex Particles）的乳液中，每个荧光纳米粒子（或称纳米球）都包含了约100-200个分子，而每个分子都含有受外界环境保护的发色团[14]。这些荧光纳米粒子不易分解，且发出的荧光亮而稳定。Taylor等[14]用纳米球标记的蛋白质来测定拉直的单个DNA分子的特定序列。复合荧光二氧化硅纳米粒子（Composite Fluorescent Silica（CFS）Nanoparticles）是外壳采用二氧化硅的新型荧光染料嵌合的纳米材料[15]。Santra等人用反相微乳液法合成了以荧光染料Ru（bpy）3与二氧化硅复合的荧光纳米颗粒，在纳米颗粒的表面上共价键合了羊抗人IgG抗体，用于识别人外周血SmIgG+B淋巴细胞，对比异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体的免疫诊断方法，其灵敏度显著提高[16]。曲会英等[17]通过控制荧光团修饰的硅烷前体在反相胶束体系中的水解缩合，合成了新型荧光团杂化纳米SiO2微球（NFHS微球），以NFHS微球为标记探针，建立了夹心型荧光免疫分析人-甲胎蛋白（AFP）的方法，测定AFP的检测限为0.05ng/mL。王柯敏等人[18]将CFS纳米粒子用于DNA杂交检测，信号得到了有效的放大，显著地提升了检测的灵敏度，检测限可至fmol以下。

1.3 金属纳米粒子的光学特性及其在生物分析

中的应用

金属纳米粒子标记物主要是指贵金属金（Au）、银（Ag）的纳米粒子，在纳米材料研究中使用最多、研究最为广泛的对象应该首推纳米金。纳米金是指金微小颗粒，其直径为1-100nm，吸收峰常随着尺寸的变化发生频移，几至几十纳米的纳米金显示出鲜艳的颜色，可作为分析中的标记物，在光谱分析中有着广泛的应用。

纳米金因灵敏度高，检测方便而在蛋白质检

测和免疫分析中广泛作为标记物被使用[19-21]。但金属纳米粒子也许是与核酸分子连接的困难以及难以具有良好的稳定性，用这种标记物检测核酸分子长期以来没有取得成功。1997年，Mirkin研究小组[22]发展了一种用纳米金标记核酸的比色分析方法，为核酸的检测提供了新的启示，使得纳米金在分子生物学领域的研究和应用重新成为目前科学家研究的热点[23]。这种方法是利用巯基修饰的寡核苷酸在一定尺寸的金纳米粒子上自组装，形成寡核苷酸包裹的金粒子探针。当金标记的探针与互补的靶核酸分子杂交时，就形成了以DNA杂交体为纽带的多个Au纳米粒子构成的网状聚集物。金粒子探针在杂交前是红色，杂交形成网状聚集物后由于光学性质的改变，变成蓝色从而指示靶分子的存在。这是一种无需分离杂交后未杂交探针的均相溶液测定法，具有很高的灵敏度，文献报道可达到fmol的检测限[22]。

2 纳米生物传感器

在生物学、医学研究中，传统的生物传感器体积较大，仅能用于组织、细胞悬液等的测量，当检测样品的尺寸缩小到微米级时，如检测活细胞或其它亚细胞组分时，实时、准确、无干扰地测量样品内化学和自然成分变得极为困难。随着新技术、新工艺的发展，制造纳米光纤探针和纳米敏感材料的技术逐步成熟，运用纳米光纤探针和纳米级的识别元件检测微环境中的生物、化学物质成为可能。运用这种高度局部化的分析方法，能够监测微环境（如：细胞、亚细胞结构）中各成分浓度的渐变以及其在空间的不均一性[24]。 2.1 光纤纳米荧光生物传感器

Kopelman等于1992年最早构建并使用了基于荧光法的光纤纳米传感器[25,26]，用于检测微环境中的pH。其工作原理是在光纤头部固定一种pH选择性荧光染料聚合物，荧光剂与质子发生可逆反应时，引起试剂相光学性质的变化，光变信号由光纤传输。通过测定荧光强度的变化可以测定pH。该纳米传感器响应时间为300ms，比传统的光纤传感器响应时间缩短99%以上，pH浓度检测下限低于传统传感器6个数量级。这些特性使之适宜于对单个细胞和亚细胞结构的检测。Kopelman

24 深圳职业技术学院学报 第6卷 等已将其用于小鼠胚胎细胞pH的检测[25]。

血红蛋白第六个配位体亚铁细胞色素C′可以结合CO和NO，然而其在自氧化后仅能结合NO，并导致结合的荧光染料发生重排反应，染料荧光强度降低。利用这一特性，Barker等人构建了一种胶体金NO荧光传感器[27]。该传感器头部直径为200nm，包被了特异性结合NO的亚铁细胞色素C′和相应的荧光染料。实验者以此传感器检测小鼠巨噬细胞内NO水平，检出限为20µmol-1mmol，响应时间为0.5s[28]。 2.2 无转换器的胞内生物传感器

将能固定于微小载体上的纳米敏感材料注入细胞内，与待测生物标志物结合时能发出荧光，在细胞外精密测光，构成一类新型传感器，即没有换能装置的胞内生物传感器。

Kopelman等最近研制了一种新型的局部生物性包埋的胶囊样探针PEBBLE传感器（probes encapsulated by biologically localized embedding）。这种传感器是一种纳米级的球状聚合物，其内含有用化学惰性基质包裹的纳米级传感分子（一种或多种特异性荧光染料，这些染料包埋于惰性基质的孔隙中）。这种聚合物为荧光染料提供了一层保护膜，确保它们不会漏入细胞内，以尽量减少因荧光染料与蛋白质结合和膜/细胞器对荧光染料的吸收所致的读数错误。同时惰性基质能防止荧光染料漏入细胞内对细胞产生毒作用，起到了保护细胞内容物的作用。在体外对PEBBLE传感器校准后可直接用于测定体内生物化学物质，它保证了原有传感器的反应特性而又无需考虑周围环境的影响。用脂溶性植入法或基因轰击将胶囊送入细胞中，根据胶囊的发光强度测定细胞中组分的含量。目前已经制成了pH，Ca2+和Cl-的球状光学纳米传感器[29-31]。这种胶囊在生物体内有很好的融合性，同时具有迅速可逆的响应。胶囊中的指示剂不易褪色，在48小时的测定中丢失量小于50%。

2.3 光纤纳米免疫生物传感器

光纤纳米免疫传感器是将光学与光子学技术应用于免疫法，利用抗原抗体能发生特异性结合的性质，将感受到的抗原量或抗体量转换成光学信号的一类传感器，这类传感器集传统的免疫测

试法与光学、生物传感技术的优点集一身，具有很高的特异性、敏感性和稳定性。同时，光纤纳米免疫传感器只是在将敏感部件上使用了纳米产品，因此既保留了原来的诸多优点，又使之能适用于单个细胞的测量。Dinh等[32]研制出一种用于检测BPT（Benzo pyrene tetrol，是一种与暴露于致癌物质苯并[a]芘相关的DNA损伤的生物标志物）的光纤纳米免疫传感器。他们首先用光纤拉制仪制作直径10-100nm的石英光纤，然后将光纤头部硅烷化，并用BPT的抗体修饰光纤头部，随后将光纤全长（修饰的光纤头部除外）镀银以防止光漏出，最后在单细胞操作的显微操纵仪/显微注射器上进行细胞穿刺及检测实验，用光电倍增管PMT记录BPT与抗体结合后产生的荧光，通过测定荧光强度的变化检测细胞内BPT的含量。该传感器的最低检出限可以达到10-21mol。

生物分子的标记和检测一直是生物分析化学领域的重要内容。纳米粒子作为生物分子的标记探针已经取得了许多有价值的成果，对生物分子的检测方法产生了重要的影响。这些具有特殊性质的纳米探针比单个分子有高得多的发光强度和光化学稳定性，作为生物分析的标记物质，可大大改善标记物的性能，显著提升现有分析方法的灵敏度。纳米生物传感器作为生物传感技术领域最近迅猛发展起来的一项新型传感器，它是研究单细胞最基本的技术，在生物分析中具有广阔的发展前景。纳米探针、纳米生物传感器等纳米生物分析材料及器件是荧光分析法未来的一个重要发展方向。

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Research on Application of Spectrofluorimetric Analysis in

Nano-bioanalysis

CUI Shufen

（School of Applied Chemistry and Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen Guangdong 518055, China）

Abstract: With the combination of nano-technology and spectrofluorimetry, important development had been made on the analysis of bio-molecular. This review especially focuses on nano-fluorescence probes and nanosensor and their characteristics and applications on bioanalysis. The study about quantum dot, novel fluorescent nanoparticles and metal nanoparticles are summarized. The development of submicron chemical fiber optic sensor, intracellular sensor and antibody-based nanoprobe are also introduced.

Key words: spectrofluorimetric analysis; nano-bioanalysis; fluorescence probe; nanosensor

（责任编辑：王璐）