纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及特性研究

第５期（总第１００期）　２００７年５月　农产品加工‘学刊　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ　ｏｆ　Ｆａｒｍ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｎｏ．５　Ｍａｙ．　文章编号：１６７１—９６４６（２００７）０５－０００４－０４　纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及特性研究　满丽莉，张丽萍　（黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆１６３３　１９）　摘要：从５种不同样品中分离得到３０株菌株，通过初筛和复筛，筛选出１株纳豆激酶高产菌株Ｔ－３，其产酶活性可　达到３　１５８．９７　Ｉｕ，ｍＬ，并对菌株的个体形态、菌落形态和生理生化特征进行了鉴定，确认菌株Ｔ－３属于枯草芽孢杆菌　属。该菌株对温度、ｐＨ值和胆盐具有较好的耐受性，并且具有良好的传代稳定性。　关键词：纳豆激酶；菌株；筛选；特性　中图分类号：Ｑ９４６．５　文献标志码：Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｆｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈ　Ｈｉ．ｓｈ　Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ　Ａｃ　ｖｉｔｙ　Ｍａｌｌ　Ｉ／ｌｉ，　Ｉａｐｉｎｇ　（Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｕｇｕｓｔ　Ｆｉｒｓｔ　Ｌａｎｄ　Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　１６３３　１９，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂ吐阿　：Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　３０　ｓｔｒａｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｆｉｖｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ，ｗｅ　ｇａｉｎｅｄ　ｓｔｒａｉｎ　Ｔ－３　ｗｈｏｓｅ　ｎａｕｏｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｙ　ｃｏｕｌｔｄ　ｒｅａｃｈ　３　１　５８．９７　ＩＵ／ｍＬ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｆｉｓｒｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｔｈｅ　ｂａｃｉＨｕｓ　ｓｕｂｉｌｉｔｓ　ｓｔａｉｎ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｄ．Ｓｔｅｒｉｎ　Ｔ－３　ｈａａｓ　ｇｏｏｄ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ　ｓａｌｔ，　ｎｄ　ｇｏｏｄ　ｇｅｎｅｒａａｔｉｏｎ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．　Ｋｅｙ　：ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ；ｓｔｒａｉｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　０引言　１．１．２培养基　酪蛋白高盐平板：酪蛋白为１％，酵母提取物为　血栓性疾病是一类严重危害人类健康和生命的常　０．５％，ＮａＣＩ为４％，琼脂为１．８％～２％，ｐＨ值为　见病与多发病ｆｌＪ。据统计，全世界每年患血栓栓塞性　７．２～７．４，在温度１２１　ｏＣ下灭菌２０　ｍｉｎ。　基础种子培养基：牛肉膏为０．３％，蛋白胨为　病的约有１　５００万人，潜在的溶栓剂市场有２０　ＮａＣＩ为０．５％，ｐＨ值为７．２～７．４，在温度１２１　ｏＣ下灭　菌２０　ｍｉｎ。　１．２力祛　１．２．１　菌种的分离与初筛　取３～４粒纳豆样品放入灭菌试管中，加入５　ｍＬ　灭菌生理盐水洗涤后，分装于离心管中，以转速　１材料与方法　５　０００　ｒ／ａｉｒｎ离心５　ｍｉｎ后，将上清液倒掉，用无菌生　１．１材料　理盐水将菌体悬起，在温度８５℃水浴５　ｍｉｎ以杀死　１．１．１供试样品　大部分的营养体及杂菌。将菌液进行１０倍的梯度稀　１％，０．０１％，分别吸　供分离的样品分别来源于日本的旭松有机纳豆、　释，选取其质量分数为１％，０．镰食山纳豆，中国的永川豆豉、太和豆豉及其自然发　取０．５　ｍＬ菌液涂布４％的酪蛋白高盐平板，在温度　酵的纳豆。　３７℃下培养２４～３６　ｈ，目测透明圈大小，在每个培养　收稿日期：２００７—０４—０２　基金项目：黑龙江省教育厅：纳豆激酶发酵工艺条件及产业化提取的研究（１０５４１１５０）。　亿美元［２１。纳豆激酶作为一种新型的溶血栓药物，与　当前使用的溶血栓药物相比，具有众多优点【３ｊ。然而　目前国内分离得到的产纳豆激酶菌种的产酶活性并不　高，如南京农业大学的梁思宇分离到的菌种最高产酶　活性为３９０．０９　ＩＵ／ｍＬｔ４］，分离筛选纳豆激酶高产菌种　是急需解决的问题之一。本研究从不同的样品中分离　菌种，筛选出１株纳豆激酶高产菌株，并对其特性进　行了研究，为纳豆激酶的生产奠定了良好基础。　１％，ＮａＣＩ为０．５％，ｐＨ值为７．２～７．４，在温度１２１　ｏＣ　下灭菌２０　ｍｉｎ。　基础发酵培养基：葡萄糖为２％，蛋白胨为２％，　作者简介：满丽莉（１９８１一），女，黑龙江人，在读硕士，研究方向：生物工程。Ｅ—ｍａｉｌ：ｍａｎｌｉｌｉｚｈａｏｐｉａｎ＠１２６．ｃｏｍ。　通讯作者：张丽萍，女，教授。　维普资讯 http://www.cqvip.com

２００７年第５期　满丽莉，等：纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及特性研究　・５・　皿中选择透明圈与菌落比值大的菌落挑菌，采用酪蛋　的基础种子培养基中，于温度３７℃下培养６０　ｍｉｎ，　　ｍＬ，经适当稀释后，涂布平板计数，计　白平板对分离出的菌株反复进行初筛，并对菌株进行　取培养液ｌ算存活率，以此判断菌株Ｔ一３对胆盐的耐受性。　斜面保藏和甘油保藏。　１．２．２菌种的复筛　（１）通过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ进行第１次　存活室一力“十』△丕回　廑妲盐盟壶适　垩　堕　一　未加入胆盐时存活的平均菌数　。　复筛：据有关资料显示，纳豆激酶的相对分子质量为　２７～３５　ｋＤａ，在ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳中，从５　株菌中筛选出杂蛋白带和在纳豆激酶分子量范围内条　带数均较少的菌株。ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳方法　（４）传代稳定性：将复筛得到的ｌ株菌在传代斜　面培养基上连续传代培养２Ｏ次，培养温度为３７℃，　培养时间为２４　ｈ。将不同代次的菌株接种于基础种　子培养基，在温度３７℃，转速１５０　ｒ／ｍｉｎ下振荡培养　见文献【５】。　（２）对第１次复筛出的菌株，通过纤维蛋白平板　测定酶活并进行第２次复筛：将相同条件下培养的种　子液以５％的接种量接种于装有１／５基础发酵培养基　的锥形瓶中，于温度３７℃，转速１５０　ｒ／ｍｉｎ下振荡培　养９６　ｈ，发酵液以转速５　０００　ｒ／ｍｉｎ，离心１０　ｍｉｎ后，　取上清液，适当稀释后即为粗酶液，加样液ｌＯ　Ｌ　于琼脂糖一纤维蛋白平板，纤维蛋白平板的具作　方法见《中华人民共和国卫生部ＷＳ一０１１（Ｘ—ＯＯ６）　９５））关于“蚓激酶的部颁标准”中“尿激酶琼脂糖一　纤维蛋白平板法”进行测定。　１．２．３纳豆激酶高产菌株的鉴定　按文献【６】的方法对菌种的个体形态、菌落形态　和生理生化进行鉴定。　１．２．４纳豆激酶高产菌株的特性研究　（１）对温度的耐受性：将菌株用基础种子培养基　培养２４　ｈ，取发酵液１　ｍＬ，采用无菌操作，将其稀　释至一定的倍数，对最后两个梯度的发酵液分别稀释　若干支，分别置于温度９３℃和９８℃中水浴５　ｍｉｎ，　１０　ｍｉｎ，１５　ｍｉｎ和２０　ｍｉｎ，流水冷却，以室温下未经　水浴的菌株作为对照，采用平板计数法计算水浴后菌　株的存活率，据此判断其对温度的耐受性。　存活率＝　镶　鞍翳。　（２）对ｐＨ值的耐受性：将菌株接种于基础种子　培养基，在温度３７℃，转速１５０　ｒ／ｍｉｎ下振荡培养　１２　ｈ，使菌种的ＯＤ鲫值控制在１．５～１．６，并将此种子　液保存备用。将此种子液以一定量接种于具有不同　ｐＨ值的基础种子培养基中，于温度３７℃下培养　４５　ｍｉｎ，取培养液１　ｍＬ，经适当稀释后，涂布平板　计数，计算相对存活率，以此判断其对ｐＨ值的耐受　性。　相对存活率＝丽　善器　挈葛蓄甄。　（３）对胆盐的耐受性：将菌株接种于基础种子培　养基，在温度３７℃，转速１５０　ｒ／ｍｉｎ下振荡培养　１２　ｈ，使菌种的ＯＤ鲫值控制在１．５～１．６，将此种子液　保存备用。将此种子液以一定量接种于含有０．００％，　０．０５％，０．１０％，０．２０％，０．３０％，０．４０％和０．５０％胆盐　１２　ｈ，使菌种的ＯＤ６００值控制在１．５一１．６。再以５％的　接种量接种在装有１／５基础发酵培养基的锥形瓶中，　于温度３７℃，转速１５０　ｒ／ｍｉｎ下振荡培养９６　ｈ，发　酵液以转速５　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ后，取上清液，　适当稀释后即为粗酶液。加样液ｌＯ　Ｌ于琼脂糖一　纤维蛋白平板测定酶活，观察不同代次的菌株产酶活　性有无变化，确定菌株的传代稳定性。　２结果与讨论　２．１菌种的分离与初筛　从５种样品中分离出菌株３Ｏ株，菌株的分离见　图ｌ。由于纳豆激酶属于丝氨酸蛋白酶，能在酪蛋白　平板上产生透明圈，因此初筛以菌种在酪蛋白高盐平　板上产蛋白酶量为指标，获得５株高产蛋白酶的菌　株，编号为Ｄ一３，ｘ一５，Ｙ一５，Ｔ－３，Ｚ一６，这５株菌　在酪蛋白平板上的溶解圈直径与菌落直径比值的平均　值越大，产蛋白酶的能力越强。　图１菌株的分离　２．２菌种的复筛　初筛菌株经过２次复筛，选出１株纳豆激酶高产　菌株Ｔ－３，并将菌株Ｔ一３进行个体形态、菌落形态及　生理生化鉴定。　２．２．１通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ进行１次复筛　据有关资料显示，纳豆激酶（ＮＫ）的分子量为　２７　０００～３５　０００　Ｄａ，ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳结果　维普资讯 http://www.cqvip.com

农产品加工・学刊　２００７年第５期　见图２，由图２可见，Ｄ一３可清晰地看到４条带，其　中３条都在ＮＫ的分子量范围内；Ｘ一５可以看到５条　带，其中２条带在ＮＫ的分子量范围内；Ｙ＿５和Ｔ一３　都有２条带在ＮＫ的分子量范围内，但后者较前者　带要清晰，说明浓度要高于前者；菌株ｚ一６产的酶　在电泳图中出现拖尾现象，说明其发生了自身降解。　Ｄ一３，ｘ一５，Ｙ一５，Ｔ一３的杂蛋白及在纳豆激酶分子　量范围内的条带数都较少，有利于纳豆激酶分离纯　化，需要用纤维蛋白平板法测定酶活，进行第２次　复筛，而ｚ一６产的酶由于发生了自身降解，无法进　行后续纳豆激酶的分离纯化，在第１次复筛中就被　排除。　图２　ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳结果　２、２、２通过纤维蛋白平板测定酶活，进行第２次复筛　菌株产纳豆激酶的活性越高，在纤维蛋白平板　上的溶圈直径越大。Ｄ一３，Ｘ一５，Ｙ一５，Ｔ一３的产酶　活测定结果见图３。由图３可知，Ｔ一３产生的纳豆　激酶活性最高，溶圈直径达到２７．８　ｍｍ，酶活为　３　１５８．９７　ＩＵ／ｍＬ　图３酶活测定结果　２．３纳豆激酶高产菌株的鉴定　２．３．１　纳豆激酶高产菌株的个体形态鉴定　分离菌Ｔ一３菌体形态和芽孢见图４。由图４可　图４分离菌Ｔ一３菌体形态和芽孢　见，革兰氏阳性菌，原生质中无聚Ｂ一羟基丁酸颗　粒，菌体大小为（Ｉ．１￣２．４）×（０．３～０．８），芽孢呈柱状，　次端生，孢囊不明显肿大。　２．３．２纳豆激酶高产菌株的茵落形态鉴定　琼脂穿刺：呈现根须状。　肉汤液体培养基：上层有一层菌膜，菌膜下呈絮　线状，膜沿管壁向上伸展１．０　ｃｍ左右，经振荡，菌　膜部分沉于底部，部分上浮。　肉汤固体斜面：菌苔为白色，生长良好，呈现小　刺状。在肉汤平板上，菌株Ｔ－３菌落形态见图５，菌　落为白色，圆形规则，大小为１．５￣９　ｍｍ，表面干燥、　褶皱，无光泽，中间有一深色圈，中间厚、边缘薄、　不透明，边缘整齐呈波状。　目５菌株　３菌落形态　２．３．３纳豆激酶高产菌株的生理生化鉴定　菌株Ｔ－３的生理生化特性见表１。表１个体形　态、菌落形态和生理生化特性鉴定结果显示，纳豆激　酶高产菌株Ｔ一３属于枯草芽孢杆菌属。　２．４纳豆激酶高产菌株的特性研究　２．４．１对温度的耐受性　菌株对温度的耐受性越强，则菌种的活性保存时　间越长，越不容易受温度影响而死亡。本实验选用了　维普资讯 http://www.cqvip.com

２００７年第５期　满丽莉，等：纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及特性研究　．７．　表１菌株Ｔ一３的生理生化特性　项目　鉴定结果　项目　鉴定结果　料烬　延长，各菌株的存活率差值在温度９３℃与９８℃也　逐渐减小，与处理时问为５　ｍｉｎ相比较，处理１０　ｍｉｎ　厌氧生长　一　产生物吲哚　一　运动性　＋　Ｈ２Ｓ　＋　Ｖ．Ｐ反应　＋　二羟丙酮　＋　Ｖ．Ｐ肉汤ｐＨ值　６．５　糊精结晶　一　ＭＲ试验　一　卵磷脂酶　＋　产酸蔗糖　＋　过氧化氢酶　＋　木糖　一　Ｂ一半乳糖苷酶　＋　葡萄糖　＋　精氨酸双水解酶　一　麦芽糖　一　苯丙氨酸脱氨　一　阿拉伯糖　一　鸟氨酸脱羧　＋　甘露醇　一　赖氨酸脱羧　＋　木糖醇　一　柠檬酸盐利用　＋　山梨醇　一　丙二酸盐利用　一　从葡萄糖产气　一　石蕊牛奶　胨化产酸　水解物酪素　＋　ｐＨ５．７肉汤生长　＋　明胶　＋　ＮａＣＩ　５％　＋　淀粉　＋　ＮａＣＩ　７％　＋　酪氨酸　一　ＮａＣＩｌＯ％　＋　脲酶　＋　温度９３℃和９８℃进行了实验，菌种的存活率与温　度的关系见图６。　ｌ　２　３　４　５　６　７　８　９　ｍ　．■．１。　　．６　５　７　档加　温度９Ｏ℃水浴处理时间ｔ／ｍｉｎ　料　妲　灶　温度９８℃水浴处理时间ｔ／ｍｉｎ　图６菌种的存活率与温度的关系　对于温度的耐受性实验表明，温度对菌株的存活　率有很大的影响。温度９３℃和９８℃虽然只相差　５℃，但是同样处理５　ｍｉｎ时，同一菌株之间的存活　率相差特别大，达到３９％，但随着处理时间的延长，　两者之间存活率的差值相对减小，处理１０　ｍｉｎ后，　二者的存活率差值为１４％。随着处理时间的进一步　后菌株存活率出现了大幅度的减小，温度９３℃与　∞　∞　∞　∞　加　Ｏ　９８℃时菌株存活率减幅分别约为７０％和４５％，当处　理时间达１５　ｍｉｎ时，其存活率均减少至不足１０％。　２．４．２对ｐＨ值的耐受性　在菌株的保存和使用过程中，常常会遇到不同的　ｐＨ值，因此，对ｐＨ值有较强的适应性是很有必要　的。菌株Ｔ一３的存活率与ｐＨ值的关系见表２。　表２菌株Ｔ一３的存活率与ｐＨ值的关系　ＰＨ值　一　相对存活率　％　对ｐＨ值的耐受性实验表明，菌株对不同的ｐＨ　值范围有较好的适应性。在ｐＨ值为５．０～８．０，菌株存　活率都可以达到７５％以上，存活率很高；在ｐＨ值　１．０～４．０，ｐＨ值对４种菌株的存活率影响较大，特别　是在很低的ｐＨ值（１．０～３．０），活菌株的损失率达　５０％多，损失较大，因此，偏酸性环境不利于菌株　Ｔ一３的生长；在ｐＨ值为９．２　ｌ　２　３　２　８　０～１０．０，活菌株的存活率　低于２０％左右，因此偏碱性环境也不利于菌株Ｔ一３　的生长。　２．４．３对胆盐的耐受性　胆盐是一种混合物，它能溶解细菌细胞的某些结　构成分。菌株的存活率与胆盐质量分数的关系见图　７。由图７可知，随着胆盐质量分数从０增至０．５％，　褂　妲　烛　０　０．０５　０．１０　０．２Ｏ　Ｏ．３Ｏ　Ｏ．４Ｏ　Ｏ．５Ｏ　胆盐质量分数％　图７菌株的存活率与胆盐质量分数的关系　（下转第１Ｏ页）　∞∞８　维普资讯 http://www.cqvip.com

农产品加工・学刊　２００７年第５期　３　３　因素影响的主次顺序为：Ｂ＞Ｃ＞Ａ＞Ｅ＞Ｄ，即固液比＞　为１Ｏ。　姗咖乙醇体积分数＞提取温度＞溶液ｐＨ值＞提取时间，　（２）本试验将为沙棘资源的进一步开发和利　最佳条件为：Ａ　２Ｂ　Ｃ￣９，Ｅ　，即提取温度为６Ｏ℃，固液　用提供有力的技术支持，可使其尽快地获得经济效益　比为１：２０，乙醇体积分数为８０％，提取时间为４　ｈ，　和社会效益。　溶液ｐＨ值为１Ｏ。从节省能源和提高效率综合考虑，　选择影响较小的浸提时间为３　ｈ，并进行工艺验证试　参考文献：　验。　…１　维吾尔自治区林业厅．沙棘资源及其利用情况　３．２最佳工艺条件的实验　『Ｇ】．全国沙棘工作会议专辑．防护林科技，１９９５，２５　最佳工艺条件不在所做的１６次实验中，因此可　（４）：５５—６３．　将它与正交试验中较好的方案比较。在乙醇体积分数　【２】　乌凤岐．提取黄酮类化合物的可行性研究ｆＪ］．辽宁工程　为８０％，料液比为１：２０，提取时间为３　ｈ，提取温　技术大学学报，２００３，２２（２）：２７５—２７７．　［３］３　王尚义，郑玉霞，刘声普．水浸提沙棘叶总黄酮的工艺　度为６Ｏ℃，溶液ｐＨ值为１Ｏ的最佳条件下。测得吸　研究ｆＪ】．沙棘，２００１，１４（２）：２７—２９．　光度值为０．０５６　２，大于方案Ａ　２Ｂ　Ｃ　的０．Ｏ４４　３，　【４】　付桂香，冯瑞芝，肖培根．不同种及不同采收时间沙棘　从而确定最优工艺条件为Ａ　２Ｂ，Ｃ，Ｄ￣Ｅ　。　叶中总黄酮的含量测定与比较【Ｊ］．中国中药杂志，　１９９７，２２（３）：１４７—１４８．　４结论　［５　５】王昌利，宋小妹，胡亚迅，等．沙棘果皮总黄酮提取分　（１）通过单因素实验和正交试验，并且充分考虑　离工艺研究ｆＪ１．中成药，１９９４，１６（９）：６－８．　到工作效率和成本，实验验证得到沙棘总黄酮常规提　【６】　刘莉华，宛晓春，李大祥．黄酮类化合物抗氧化活性构　取的最佳条件是：提取温度为６Ｏ℃，固液比为１：２０，　效关系的研究进展ｆＪ］．安徽农业大学学报，２００２，２９　乙醇体积分数为８０％，提取时间为３　ｈ，溶液ｐＨ值　（２３）：２６５—２７０．　（上接第７页）　起点，也是影响纳豆激酶产量和纯化的关键点。　菌株Ｔ一３的存活率逐渐下降，但胆盐质量分数高达　（２）本文通过从５种不同的样品中分离得到３Ｏ　０．５％时，菌株存活率也仅减少了１０．７５％。因此，菌　株菌种，经过第１次初筛和第２次复筛，最终筛选得　株Ｔ一３对胆盐具有很好的耐受性。　到１株酶活达到３　１５８．９７　ＩＵ／ｍＬ的菌株Ｔ一３，同时根　２．４．４传代稳定性　据菌株的个体形态、菌落形态、生理生化特征鉴定为　菌株Ｔ一３在传代培养基斜面连续传代２Ｏ次，培　枯草芽孢杆菌属。　养温度为３７℃，培养时间为２４　ｈ。发酵后取发酵液　（３）菌株Ｔ一３对温度、ｐＨ值和胆盐具有良好的　上清液，用纤维蛋白平板法测定酶活，菌株Ｔ一３的　耐受性，而且菌株传代２Ｏ次，其各代产纳豆激酶的　传代稳定性见图８。图８结果表明，不同代次菌株　活性基本保持不变，说明菌种的传代稳定性较好。　Ｔ一３的产酶能力基本保持不变，说明菌种传代稳定性　较好。　参考文献：　…１　陈志文．产纤溶酶枯草芽孢杆菌发酵条件的研究ｆＪ］．食　品工业科技，２００３，５：２３～２６．　【２】　周新萍，徐尔尼．胃蛋白酶对纳豆激酶的化学修饰研究　ｆＪ】．食品科学，２００５，７：１９．　［３　３］Ｕｒａｎｏ　Ｔ，Ｉｈａｒａ　Ｈ，Ｕｍｅｍｕｒａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｐｒｏｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　ＮＡＴ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｃｌｅａｖｅｓ　ａｎｄ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｔｙｐｅ　１『Ｊ】．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００１，２７６（２７）：２４　６９０．　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１　１２　１３　１４１５　１６１７　１８　１９　［４］　梁思宇．枯草杆菌溶纤酶高产菌株的选育及发酵条件的　优化．『Ｊ］．南京农业大学学报，２０００，６：１８．　传代次数　【５］５　Ｒ．Ｅ．布坎南，Ｎ－Ｅ吉布斯．伯杰细菌学鉴定手册【Ｍ】．　图８菌株Ｔ一３的传代稳定性　北京：科学出版社，１９８４：７３５．　［６】　杨革．微生物学实验教程［Ｍ】．北京：科学出版社，　３结论　２００５：７６．　（１）纳豆激酶高产菌株筛选是对纳豆激酶研究的