周洁论文

摘要 目的：确立蚕沙中焦脱镁叶绿酸a的分离提纯方法，为焦脱镁叶绿酸a的进

一步反应提供足够的反应物。方法：对糊状叶绿素用Hynninen选择性酸法水解进行粗提，得到脱镁叶绿酸a，经浓盐酸进一步反应，提取出焦脱镁叶绿酸a粗品；采用硅胶柱对粗品进行分离提纯，固定相用200-300目硅胶，第一次分离流动相用氯仿：丙酮：甲酸=1000:60:20，以高效薄层板点样合并；再用氯仿：丙酮：甲酸：甲醇=1000:50:20:30细分，用HPLC检测所分产物纯度，合并；其结构由UV、IR、MS验证。

结果：对购回的糊状叶绿素进行粗提，按粗提物计算，焦脱镁叶绿酸a的收率为6.23%;

分离所得的焦脱镁叶绿酸a的纯度经HPLC检测多数在80%-90%。结论：本分离提纯方法简单、灵活、可操作性强，对焦脱镁叶绿酸a的分离效果可靠，对焦脱镁叶绿酸的进一步结构修饰具有重要的意义。

关键词 ：蚕沙；焦脱镁叶绿酸a；硅胶柱；分离提纯

The Isolation and Purification of Pyrophaeophorbide a from

Silkworm Shit monitor

ABSTRACT ：OBJECTIVE: Research and find an ideal method for the purification of Pyrophaeophorbide a from silkworm excrement, so that offer enough reactant for the further modification of Pyropheophorbide a. METHODS: At first, we make a coarse extraction on pasty Chlorophyll a and get Pheophorbide a by the method of Hynninen sective acid hydration. Through further strong hydrochloric acid recaction, we preperate crude Pyropheophorbide a. The destination substance is isolated by silica gel

column.Stationary:200-300 mesh column-layer chromatographic silica gel. The first time we use Trichloromethane: Acetone: Formic = 100: 60: 20 as mobile phase. Collect Pyropheophorbide a that is isolated by the first time. The second time use Trichloromethane: Acetone: Formic: Methanol=1000:50:20:30. Merge the outcome after its purity is detected by HPLC; The structure of the target compound was characterized by IR, UV-Vis and MS.RESULTS: According to the calculation of crude Pyropheophorbide a，the yield of Pyropheophorbide a is 23.% and its purity quotient ranks 80%-90% through the detection of HPLC.CONCLUSION：It is a successful method by which Pyropheophorbide a from silkworm excrement is purified.The method is simple,flexible and operable.Further modification of Pyropheophorbide a’s structure seems to be of importance as well. KEY

WORDS:silkworm

excrement;Pyropheophorbide

a;silica

gel

column

chromatography;purification

前 言

恶性肿瘤严重威胁人类健康，居世界卫生组织（WHO）预测，到2020年，每年新发恶性肿瘤病人数将达到1500万。在肿瘤治疗的众多方法中，光动力疗法（Photodynamic Therapy,PDT）以其有效、安全、副作用小、可协调性、可重复性和相对成本低等优点脱颖而出，并在肿瘤的治疗中显示出很强的生命力，目前，光动力疗法已被美、英、德、日等国家正式用于临床多种肿瘤的治疗。其治疗基础为先给予对肿瘤组织有选择性摄入作用的光敏剂，然后用一定波长的光辐照瘤区，诱发光敏剂产生光动力反应，导致肿瘤组织坏死而显示治疗作用。

肿瘤光动力治疗的疗效取决于光敏剂的光敏活性，但现在临床使用的光敏剂血卟

啉衍生物（hematoporphyrin derivative,HpD）、光敏素II（photofrin II）等均为组成不定的复杂卟啉混合物，存在选择性定位差、在红光区（λ＞600nm）的吸收系数小等问题，因而近年来人们研究光动力治癌新药的注意力都转向了在红光区吸收系数高且结构明确的叶绿素a降解产物及其衍生物。焦脱镁叶绿酸啊属叶绿素a的降解产物，其在近红外区（λ在800nm-2500nm之间）吸收系数高，在采用更长波长的激光照射光敏化中占有优势，但对肿瘤作用的靶向性差，经过对其结构修饰后可改变其靶向性。

蚕沙（家蚕粪）是蚕业的主要副产物之一，其中，叶绿素含量占蚕粪干物的1%左右，是一种丰富廉价的叶绿素资源，而蚕沙中占叶绿素总量75%以上是叶绿素a。焦脱镁叶绿酸a可由叶绿素a分子脱去镁离子后进一步水解得到，其结构如下。由蚕沙粗提物制备焦脱镁叶绿酸a的过程中产生许多副产物，因此需对焦脱镁叶绿酸a粗品进行进一步分离提纯。本实验通过硅胶柱层析法，探究了多种因素对焦脱镁叶绿酸a分离纯化的影响。

焦脱镁叶绿酸a结构

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂 蚕沙中提取的糊状叶绿素（海宁凤鸣叶绿素有限公司, 批号：

20100209，焦脱酶叶绿酸a含量：10.78%）；焦脱镁叶绿酸a对照品（上海先辉医药科技有限公司）；氯仿，丙酮，甲醇[重庆川东化工（集团）有限公司 化学试剂厂] ，甲酸（成都市科龙化工试剂厂），皆为化学纯（CP）；乙腈（Burdick＆Jackson），为色谱纯（HPLC）；TFA (Burdick＆Jackson)，为色谱纯（HPLC）；200-300目柱层层析硅胶（安徽良臣硅原材料公司）。

1.2 仪器 旋转蒸发仪：日本，Yamato RE300型；高效液相色谱仪：美国，Agilent

1200 Series；质谱仪：岛津，LCMS-2010型；Varian 0型红外光谱仪（美国Varian公司）；DU800型紫外可见分光光度计（美国Beckman公司）；SHZ-D（III）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；真空干燥箱：巩义市予华仪器有限责任公司；

1．3 溶液的配置

1.3.1 第一次分离流动相的配制 用100ml量筒量取20ml甲酸，然后往甲酸中

倒入60ml丙酮。另用1000ml量筒量取1000ml氯仿，将两量筒的溶液倒入大烧杯中，充分搅拌混匀。

1.3.2 第二次分离流动相的配制 用100ml量筒量取20ml甲酸，再取30ml甲醇，

然后往甲酸、甲醇中倒入50ml丙酮。另用1000ml量筒量取1000ml氯仿，将两量筒的溶液倒入大烧杯中，充分搅拌混匀 。

2 实验方法

2.1 糊状叶绿素的粗提 称取糊状叶绿素200g,溶于500ml乙醚中，加入36%盐

酸1000ml，冰浴条件下充分搅拌反应1h。倒入分液漏斗中静置1h，分取下层酸液，加水1000ml稀释，用10mol/L NaOH中和至PH5-6，抽滤，干燥，得到粗提物。

2.2 粗提物的第一次分离 取200-300目硅胶H300ml装柱，称取160mg粗提物，

用流动相溶解后抽滤，湿法上样，流动相用氯仿：丙酮：甲酸=1000:60:20，流速为4ml/min，待明显分出三带后（如下），将柱子用加压泵打干。撬取棕黑色带，用氯仿润湿后抽滤，用丙酮将其中的物质洗出。旋干后用高效薄层板对照标准品点样，展开剂用氯仿：丙酮：甲酸：甲醇=1000:50:20:30，根据点样展开情况（如下）合并收集，将含有焦脱镁叶绿酸的混合物进行第二次分离。

第一次分离硅胶柱图 被分离物质旋干后点板图

（从左至右：黄褐色带 棕黑色带 对照点）

--黄褐色带 --棕黑色带

2.3 粗提物的第二次分离 取200-300目硅胶H300ml装柱，称取100mg经第一

次分离的焦脱镁叶绿酸粉末，用流动相溶解后抽滤，湿法上样，流动相用氯仿：丙酮：甲酸：甲醇=1000:50:20:30，流速为4ml/min，接取第一带，30ml/瓶，旋干后经HPLC检测，按纯度合并收集，得到较纯的焦脱镁叶绿酸a。

2.4 HPLC定性分析及纯度检测 将第二次分离所接取的溶液用氯仿稀释到一定

浓度。流动相：A瓶为含5%乙腈和0.1%TFA的水溶液；B瓶为含0.1%TFA的乙腈溶液；以B瓶70-100%，15min梯度洗脱。

2.5 IR对焦脱镁叶绿酸a结构的鉴定 取分离产物与KBr混合压片，进行IR扫描。

2.6 UV对焦脱镁叶绿酸a结构的鉴定 用氯仿溶解分离产物，得到一定浓度的溶液，进行紫外扫描。

2.7 MS对焦脱镁叶绿酸a结构的鉴定 取分离产物固体少许，进行质谱鉴定。

3 实验结果

3.1 HPLC检测结果 经两次分离后，HPLC检测得到了较纯的焦脱镁叶绿酸a，其

与标准品的对照如下：

焦脱镁叶绿酸a对照品（纯度80%）

分离所得焦脱镁叶绿酸a（纯度96%）

3.2 焦脱镁叶绿酸a的鉴定

3.2.1 IR扫描图谱 √=3391cm-12921cm-11692cm-1等吸收峰都与焦脱酶叶绿酸

的IR图谱一致。

3.3.2 UV图谱 焦脱酶叶绿酸a在409nm和6nm(可见红光区)出现了两个特征

吸收峰。在6nm处较强吸收表明教育欧美叶绿酸a对太阳光有很好的吸收截面，复核人们对理想光敏剂的要求。

4 讨论

焦脱酶叶绿酸a是蚕沙中的叶绿素a的降解产物，其制备方法文献报道有酶解法、以脱镁叶绿酸a在克力丁（collidine）中通氮气回流反应1.5h来合成和Hynninen

选择性酸法水解，因酸法水解可由糊状叶绿素一步反应制备焦脱酶叶绿酸a：

本实验选取此法。再用此法提取时，需把握搅拌时间，有脱镁叶绿酸a对照品的条件下，可一边搅拌一边用HPLC检测，待脱镁叶绿酸a峰基本消失即反应到时。

焦脱酶叶绿酸a的分子中含有一个羧基，在分离提纯选择流动相时，应注意流动相的极性。摸索的条件中，三组分条件走得较好的是氯仿：丙酮：甲酸=1000：60:20，四组分条件走得较好的是氯仿：丙酮：甲酸：甲醇=1000:50:30:20和1000:50:20:30，但因前者甲酸含量相对较高，不利于甲酸在其他三种液体中的溶解，因此后者较好。固定相的摸索中，用过比300目更细的硅胶，但分离过程中出现了物质的吸附现象；硅胶G的分离效果也较好，但成本高于硅胶H，所以固定相选用200-300目的硅胶H。

走柱用加压泵和提高流速可使分离速度加快，但同时降低了分离效果，最终流速确定在4ml/min。

TLC定性鉴别时，因高效薄层板（HPTLC）与自推薄层板比较有差异小、效果好且操作方便的优点，所以在点样时选用高效薄层板。

5 结论

本实验采用选择性酸水解和硅胶柱分离的方法，提取分离出了焦脱酶叶绿酸a，经HPLC检测，纯度为80%-90%。此组分的成功分离纯化，为其进一步的化学修饰和结构改造提供了物质基础，对研制新的、有效的治癌光敏剂，造福于人类具有一定的实际应用价值。

第一次分离撬出的硅胶含有部分甲酸，硅胶里的物质被洗出后很难经旋转蒸发仪旋干，为干燥保存带来困难。建议可积累多次分离后撬出的硅胶，洗出物质后，用蒸馏水萃取出氯仿溶液，经无水硫酸钠干燥后可轻松方便地旋干。

参考文献

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