影响凝胶迁移率实验因素的教学改进

ＩＳＳＮ１６７２－４３０５ＣＮ１２－１３５２／Ｎ

实　　验　　室　　科　　学ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　

ＳＣＩＥＮＣＥ

第２１卷　第５期　２０１８年１０月

Ｖｏｌ􀆰２１　Ｎｏ􀆰５　Ｏｃｔ􀆰２０１８

影响凝胶迁移率实验因素的教学改进

周　超，赵翔宇，高新起，郭兴启，苏英华

（山东农业大学生命科学学院，山东泰安　２７１０１８）

摘　要：凝胶迁移实验（ＥＭＳＡ－ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃＭｏｂｉｌｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙ）是一种研究蛋白质与核酸相互作用的常用实验技术。在凝胶迁移率实验的教学工作中，由于受实验材料的影响，尤其是ＥＭＳＡ探针浓度的变化，对实验结果的影响很大。为进一步提高实验教学效果，将探针浓度对实验结果的影响进行了比较。通过设置一系列浓度梯度实验，发现采用浓度为５ｎｍｏｌ的探针实验效果最好，改进后的实验效果更加明显。关键词：凝胶迁移率实验；实验教学；探针浓度

中图分类号：Ｑ－３３１　　文献标识码：Ｂ　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４３０５．２０１８．０５．００２

Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅａｃｈｉｎｇｉｎｔｈｅ

ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｍｏｂｉｌｉｔｙｓｈｉｆｔａｓｓａｙ

ＺＨＯＵＣｈａｏ，ＺＨＡＯＸｉａｎｇ－ｙｕ，ＧＡＯＸｉｎ－ｑｉ，ＧＵＯＸｉｎｇ－ｑｉ，ＳＵＹｉｎｇ－ｈｕａ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉａｎ２７１０１８，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃＭｏｂｉｌｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙ（ＥＭＳＡ）ｉｓａｃｏｍｍｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ．ＩｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｔｅａｃｈｉｎｇｏｆＥＭＳＡ，ｔｈｅｒｅｉｓａｇｒｅａｔｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｕｅｔｏｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＥＭＳＡｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｉｓｍｏｒｅｏｂｖｉｏｕｓ．

ｏｒｄｅｒｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅａｃｈｉｎｇｅｆｆｅｃｔ，ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＥＭＳＡｐｒｏｂｅｓａｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｂｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５ｎｍｏｌｉｓｂｅｓｔ．ＴｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔＫｅｙｗｏｒｄｓ：ＥＭＳＡ；ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｔｅａｃｈｉｎｇ；ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｂｅｓ　　凝胶迁移或电泳迁移率实验，是一种近年来广技术主要用于研究核酸结合蛋白和其相关的结合序列的相互作用，可同时用于定性和定量分析［１］。最初，这一技术主要用于研究ＤＮＡ结合蛋白，随着实验技术的不断改进，目前该实验技术亦可用于ＲＮＡ互作蛋白的相关研究

［２］

该实验需要将纯化的蛋白质或细胞粗提液和生物素标记的ＤＮＡ或ＲＮＡ探针一同在室温下孵育［３－５］，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离蛋白核酸复合物和游离的探针。目的蛋白可以利用原核或真核蛋白表达系统进行特异表达纯化，也可利用细胞核抽提液检测转录因子一类的ＤＮＡ结合蛋白与目的探针的相互作用［６］。

在实际实验教学过程中，发现此实验存在一些

泛应用于生物化学及分子生物学中的实验技术。该

速有效地分析生物体内相关机制的关键互作因子，是目前部分高等院校硕士研究生实验课中一个很好的基础实验项目，此实验比较适合在实验课程

。利用ＥＭＳＡ实验可以快

问题，影响了实验结果的可靠性。由于现在普遍采用生物素将探针进行标记，在探针浓度较高时会出现较多的非特异条带，影响对实验结果的观察；当探针浓度偏低时，部分互作能力比较弱的阳性条带又很难显示出来［７］。

此外，针对研究生实验授课的具体要求，实验课

中最先开设，一方面可以强化学生理论知识的学习，另一方面也比较适合刚进入实验室的硕士研究生。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

号：鲁教高字［２０１２］１４号）。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　基金项目：山东省高等教育名校建设工程项目（项目编

　　　时有限，很难让学生自己去摸索最佳的生物素探针

周超，等：影响凝胶迁移率实验因素的教学改进

反应浓度，为提高实验教学效果，使实验结果更有利于学生观察，笔者查阅了近年来发表的一些相关资料，并结合不同的探针浓度进行试验，以期找到比较适合的探针浓度。

５

浓度稀释至５ｎｍｏｌ／Ｌ。相对应的探针标号标记为ｉ－

ｐ。将每种探针的浓度均稀释为５ｎｍｏｌ／Ｌ。根据凝胶迁移实验的反应条件，每种反应体系按表２加入相应试剂，加入试剂单位为μＬ。

表２　浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ生物素探针检测

试验号ｂｕｆｆｅｒ甘油探针水

２１１１６ｉ

２１１１６ｊ

２１１１６ｋ

２１１１６ｌ

ｍ２１１１６

２１１１６ｎ

２１１１６ｏ

２１１１６ｐ

１　试剂与仪器

１．１　试剂

ＥＭＳＡ结合缓冲液：１０ｍＭＴｒｉｓ，５０ｍＭＫＣｌ，２．５ｍＭＤＴＴ，ｐｏｌｙ（ｄＩ－ｄＣ），１０μｇＢＳＡ，４％甘油。

生物素探针检测试剂：ＢｌｏｃｋｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，４×ｗａｓｈ

Ｂｕｆｆｅｒ，ＳｕｂｓｔｒａｔｅＥｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ，ＳｔａｂｉｌｉｚｅｄＳｔｒｅｐ⁃ｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰＣｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｌｕｍｉｎｏｌ／ＥｎｈａｎｃｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎ，ＳｔａｂｌｅＰｅｒｏｘｉｄｅＳｏｌｕｔｉｏｎ（以上试剂由Ｔｈｅｒｍｏ公司生物素探针检测试剂盒提供）。１．２　仪器

２．３　检测５μｍｏｌ／Ｌ探针与ＤＮＡ结合蛋白相互作用

将标号为ａ－ｈ的探针分别与ＤＮＡ结合蛋白在

室温条件下进行孵育３０ｍｉｎ，检测不同生物素标记的探针与ＤＮＡ结合蛋白之间的相互作用，每种反应体系按表３加入相应试剂，加入试剂单位为μＬ。

表３　浓度为５μｍｏｌ／Ｌ探针与ＤＮＡ结合蛋白相互作用试验号ｂｕｆｆｅｒ甘油探针蛋白水

ａ－１２１１１０６

ｂ－１２１１１０６

ｃ－１２１１１０６

ｄ－１２１１１０６

ｅ－１２１１１０６

ｆ－１２１１１０６

ｇ－１２１１１０６

ｈ－１２１１１０６

恒压电源，电泳槽，转膜仪，紫外交联仪，水平摇床。

２　实验方法

针对该实验所用的实验材料较之传统的生化及分子生物学实验有所不同，所用的实验材料需经过特殊处理。比如，生物素标记的探针需提前在相关公司进行合成，所用的核酸结合蛋白应在超低温冰柜进行保存等等。所以在实验进行之前需要提前将所需实验材料准备完善。

本实验目的为利用不同浓度的生物素标记探针，探究浓度对实验结果的影响。通过对不同浓度生物素标记探针显色反应的观察，确定最适合的反应浓度。

２．１　检测５μｍｏｌ／Ｌ探针对ＥＭＳＡ实验的影响

分别合成８种含有不同的ＤＮＡ结合蛋白核心

２．４　检测５ｎｍｏｌ／Ｌ探针与ＤＮＡ结合蛋白相互作用

将标号为ｉ－ｐ的探针分别与ＤＮＡ结合蛋白在

室温条件下进行孵育３０ｍｉｎ，检测不同生物素标记的探针与ＤＮＡ结合蛋白之间的相互作用，每种反应体系按表４加入相应试剂，加入试剂单位为μＬ。

表４　浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ探针与ＤＮＡ结合蛋白相互作用试验号ｂｕｆｆｅｒ甘油探针蛋白水

ｉ－１１１１０６２

ｊ－１２１１１０６

ｋ－１２１１１０６

ｌ－１２１１１０６

ｍ－１２１１１０６

ｎ－１２１１１０６

ｏ－１２１１１０６

ｐ－１２１１１０６

结合元件的生物素标记探针，探针标号为ａ～ｈ。将每种探针的浓度均稀释为５μｍｏｌ／Ｌ。根据凝胶迁移实验的反应条件，每种反应体系按表１加入相应试剂，加入试剂单位为μＬ。

表１　浓度为５μｍｏｌ／Ｌ生物素探针检测

试验号ｂｕｆｆｅｒ甘油探针水

ａ

ｂ

ｃ

ｄ

ｅ

ｆ

ｇ

ｈ

３　实验结果

２１１１６

２１１

２１１１６

２１１

２１１１６

２１１１６

２１１１６

２１１

凝胶迁移实验现在广泛用于研究转录因子与启

动子之间相互作用的验证，当生物素标记的探针与目的蛋白混合孵育时，混合物中与ＤＮＡ探针存在相互作用的蛋白即可以与探针形成ＤＮＡ－Ｐｒ复合物，由于这种复合物的分子量较大，所以在进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移速率就会变慢，而没有结合目的蛋白的探针迁移速率则较快。进行孵育后的目的蛋白与ＤＮＡ探针的混合物，在进行聚丙烯

１６１６１６

２．２　检测５ｎｍｏｌ／Ｌ探针对ＥＭＳＡ实验的影响

将上述８种含有不同的ＤＮＡ结合蛋白核心结

合元件的生物素标记探针，进行进一步稀释，将探针

６　　　　　　　　　　酰胺凝胶电泳并完成转膜后，ＤＮＡ－Ｐｒ复合物会在游离探针的另一端形成一条滞后带，证明目的蛋白与相应的探针发生了相互作用。

本实验前期首先从上海生物工程有限公司合成了８种不同的生物素标记探针，设计了两种浓度梯度。另外，利用大肠杆菌原核表达系统，将目的蛋白进行了体外表达，并将蛋白冷冻保存。３．１　检测５μｍｏｌ／Ｌ探针对ＥＭＳＡ实验的影响

在实验过程中，生物素标记的探针首先经过转膜

操作固定到带正电的纤维素膜上。然后使用ＨＲＰ标记的链霉亲和素偶联物检测相应的生物素标记探针，借助化学发光仪观察条带在膜上的具体位置。

由图１可以看出，在相同的曝光强度下，５μｍｏｌ／Ｌ的探针浓度显色效果不理想，出现很多弥散的杂乱条带。这些非特异条带的出现，很容易影响ＤＮＡ与蛋白的结合效率，影响对实验结果的判断。

（ａ）Ｌ浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ａ探针显色结果；果的；（ｂｄ）探针显色结果浓度为５μｍｏｌ；（ｃ）／Ｌ的浓度为ｄ探针显色结果５μｍｏｌ／（ｂ）Ｌ的浓度为ｃ；（探针显色结５μｍｏｌ／

ｅ）浓度为５μｍｏｌ色结果／Ｌ；（ｇ）的ｅ浓度为探针显色结果５μｍｏｌ／Ｌ；（ｆ）的ｇ浓度为探针显色结果５μｍｏｌ／Ｌ；（的ｈ）ｆ探针显浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ｈ探针显色结果

图１　浓度为５μｍｏｌ／Ｌ不同探针的显色结果

由上述实验结果得出如下结论，当探针的浓度达到５μｍｏｌ／Ｌ时，会出现除目的探针以外的非特异条带。而这种非特异条带的出现会对后期实验结果的分析产生干扰。

３．２　由图检测２５ｎｍｏｌ可以看出／Ｌ探针对，将探针的浓度降低到ＥＭＳＡ实验的影响

５ｎｍｏｌ／Ｌ

５ｎｍｏｌ时，非特异条带即可消失。实验结果表明，浓度为

的要求／Ｌ。

的生物素标记探针可以满足凝胶迁移实验３．３　由图检测３５μｍｏｌ可以看出／Ｌ探针与，利用ＤＮＡ５μｍｏｌ结合蛋白相互作用

／Ｌ生物素标记探

（ｉ）的ｊ浓度为探针显色结果５ｎｍｏｌ／Ｌ；的（ｋ）ｉ探针显色结果浓度为５ｎｍｏｌ；／Ｌ（ｊ）的浓度为ｋ探针显色结５ｎｍｏｌ／Ｌ果；（ｌ）浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的ｌ探针显色结果；（ｍ）浓度为５ｎｍｏｌ针显色结果／Ｌ的ｍ；（ｏ）探针显色结果浓度为５ｎｍｏｌ；（／ｎ）Ｌ的浓度为ｏ探针显色结果５ｎｍｏｌ／Ｌ的；（ｎｐ）探浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的ｐ探针显色结果。

图２　浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ不同探针的显色结果

针进行凝胶迁移实验，会产生较多的非特异结合的滞后带。而这些滞后带的存在，大部分都是假阳性的实验结果，对后期实验结果的观察产生了很大的干扰，导致无法准确判断目的蛋白与生物素标记的探针产生的结合条带。

（ａ果；（ｂ－１）－浓度为１）浓度为５μｍｏｌ５μｍｏｌ／Ｌ的／Ｌａ的探针与目的蛋白互作的显色结ｂ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｃ－１）浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ｃ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｄ－１）浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ｄ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｅ－１）浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ｅ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｆ－１）浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ｆ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｇ－１）浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ｇ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｈ－１）浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的ｈ探针与目的蛋白互作的显色结果。

图３　浓度为５μｍｏｌ／Ｌ的探针与目的蛋白相互作用的显色结果

３．４　由图检测４５可以看出ｎｍｏｌ／Ｌ探针与，与利用ＤＮＡ５μｍｏｌ结合蛋白相互作用

／Ｌ生物素标记探针相比，将探针浓度降至５ｎｍｏｌ／Ｌ后，探针呈现出的非特异杂带减少。且显色结果表明，所合成的８条生物素标记的探针，其中３条是可以与目的蛋白在体外直接结合的。

周超，等：影响凝胶迁移率实验因素的教学改进

７

（ｉ果－；（ｊ１）－浓度为１）浓度为５ｎｍｏｌ５ｎｍｏｌ／Ｌ的／Ｌｉ的探针与目的蛋白互作的显色结ｊ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｋ－１）浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的ｋ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｌ－１）浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的ｌ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｍ－１）浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的ｍ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｎ－１）浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的ｎ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｏ－１）浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的ｏ探针与目的蛋白互作的显色结果；（ｐ－１）浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的ｐ探针与目的蛋白互作的显色结果。

图４　浓度为５ｎｍｏｌ／Ｌ的探针与目的蛋白相互作用的显色结果

４　ＥＭＳＡ影响实验结果的其它因素

功的关键因素也很多是一个比较复杂的实验技术，在实验教学工作中，，影响其成

我们发现和总结了一些导致学生实验失败的因素。４．１　首先蛋白样品制备的质量

，由于凝胶迁移率实验所用的蛋白大部分

为核蛋白，而在利用普通的核蛋白抽提试剂进行蛋白提取时很难保持蛋白原有的天然活性和构像，导致目的蛋白与核酸不能结合，造成假阴性的结果［８－１０］核蛋白的浓度要求还是比较高的；其次，蛋白的浓度也很关键，一般要求在，ＥＭＳＡ实验对μＬ果。以上为了避免以上因素对实验的干扰，若浓度太低则会影响结合反应１μｇ／，在实验教学，得不到结开展的过程中，一般都利用大肠杆菌蛋白表达系统，

这样既可以最大限度的保持蛋白的活性，又能获得足够数量的蛋白。

４．２　凝胶迁移实验可以快速的检测目的蛋白与核酸反应体系的缓冲液组成

的结合，但要成功捕获想要的特异结合条带，需要进行复杂的参数优化。其中，反应体系的缓冲液组成对实验的影响较为明显［１１－１２］电点调整反应的ｐＨ值，另外还需考虑转录因子在与，可以根据不同蛋白的等核酸发生结合反应时，是否需要有辅助因子（比如锌或镉等金属离子）的参与［１３］。同时，为提高蛋白与核

酸的结合效率，反应总体积应不大于２０μＬ。

５　结语

凝胶迁移率实验并不是一个非常难的实验，但在实际的教学工作中，大部分学生却不容易做出理想的实验结果。得不到可靠实验结果的原因是多方面的，但其中最主要的一个因素便是对生物素标记探针的浓度控制达不到要求。针对这一问题，我们通过反复地进行试验，找到了在凝胶迁移率实验教

学过程中探针的最适合浓度，使大部分学生都可以比较容易地得到理想的实验结果，逐渐地提高实验操作能力。

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基因启

（６）：７１０－７１９．

收稿日期：２０１７－０９－０８修改日期：２０１７－１０－２０

作者简介：周超（１９８３－），男，山东泰安人，博士，讲师，主要

研究方向为植物发育分子生物学。