一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112522168 A(43)申请公布日 2021.03.19

(21)申请号 202011424552.7(22)申请日 2020.12.08

(71)申请人 江南大学

地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800

号(72)发明人 郑璞　陈春梅　陈鹏程　吴丹　(74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代

理事务所(普通合伙) 32257

代理人 王玉仙(51)Int.Cl.

C12N 1/21(2006.01)C12N 15/74(2006.01)C12N 15/60(2006.01)C12N 15/31(2006.01)C12P 7/46(2006.01)

()发明名称

一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用(57)摘要

本发明公开了一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。本发明通过在产琥珀酸放线菌中过表达谷氨酸脱羧酶和氨基酸转运载体，通过谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成γ‑氨基丁酸，再通过氨基转运载体把γ‑氨基丁酸转运到胞外，在此过程中消耗一个质子，中和酸的压力，提高产琥珀酸放线菌的耐酸能力，从而降低发酵过程pH调节剂用量和副产物乙酸的生成。

C12R 1/01(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页序列表9页 附图2页

CN 112522168 ACN 112522168 A

权　利　要　求　书

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1.一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌是在产琥珀酸放线杆菌中过表达谷氨酸脱羧酶GadB和氨基酸转运载体GadC。

2.根据权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的谷氨酸脱羧酶GadB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的氨基酸转运载体GadC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求2所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌中，所述的谷氨酸脱羧酶GadB还包括删除C末端的11个氨基酸的谷氨酸脱羧酶GadB。

5.根据权利要求2或4所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，其特征在于，编码所述的谷氨酸脱羧酶GadB的基因或编码删除C末端的11个氨基酸的谷氨酸脱羧酶GadB的基因，与编码所述的氨基酸转运载体GadC的基因之间还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的RBS片段。

6.根据权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，其特征在于，编码所述的谷氨酸脱羧酶GadB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述的氨基酸转运载体GadC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌是以产琥珀酸放线杆菌ATCC 55618、产琥珀酸放线杆菌CGMCC NO.1593、产琥珀酸放线杆菌CCTCC NO：M 2012036、产琥珀酸放线杆菌CGMCC NO.1716或产琥珀酸放线杆菌CCTCC M2011399为宿主菌。

8.根据权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌是以pLGZ922作为表达载体。

9.一种权利要求1～8任一项所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)重组质粒构建：将采用RBS连接的谷氨酸脱羧酶基因gadB与氨基酸转运载体基因gadC，与表达载体pLGZ922连接在一起，获得过表达载体gadB‑gadC‑pLGZ922；

(2)基因工程菌制备：将过表达载体gadB‑gadC‑pLGZ922转入宿主菌中，筛选获得所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌。

10.权利要求1～8任一项所述产琥珀酸放线杆菌基因工程菌在生产琥珀酸中的应用。

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一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

[0001]本发明涉及一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

[0002]琥珀酸(又名丁二酸)是一种C4平台化学品，是一种天然有机酸，广泛存在于动物、植物、人与微生物中。它能广泛应用于食品行业、化工行业和医药行业中。近些年来，由于琥珀酸可以作为C4平台化合物用于合成大量化学品和生物可降解塑料，且其被美国能源部列为12种有潜质的化学品之一。

[0003]产琥珀酸放线杆菌是一株从牛的瘤胃中分离的高产琥珀酸的革兰氏阴性菌，它能天然的生产琥珀酸，且能利用广谱的碳源用于生产琥珀酸，是生产琥珀酸最有潜力的微生物之一。密西根大学筛选的产琥珀酸放线杆菌ATCC 55618最适生长和产酸的pH为6.8(US 5573931，US 5521075，US 5504004等)；南京工业大学姜岷等筛选的产琥珀酸放线杆菌CGMCC NO.1716的pH生长范围为5.0‑8.0，最适产酸pH 7.0(ZL 201610382379.6，ZL 201410212929.0，ZL 2006100815.9等)；本实验室筛选的产琥珀酸放线杆菌CGMCC1593的pH维持6.2‑7.1，可满足生长和产酸的需求(ZL 200810146688.9，ZL 201210056568.6，ZL 201110209999.7等)。

[0004]虽然利用产琥珀酸放线杆菌成功地实现了琥珀酸的高产率，但在其发酵过程中，随着琥珀酸与其他副产物酸的不断累积，使培养基的pH不断降低，而产琥珀酸放线杆菌的耐酸能力较弱，在酸性条件下易死亡，且大多数发酵都是在中性条件下进行的，因此需要大量的碱来维持中性pH条件，同时存在细菌污染的可能性。此外，在下游的工业处理步骤中，必须消耗大约等量的酸来将琥珀酸重新酸化为琥珀酸，这不仅会增加整个过程的成本，而且由于排放了大量以离子为主的废水，也会对环境造成破坏。发明内容

[0005]为解决上述技术问题，本发明提供一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，通过在产琥珀酸放线菌中过表达谷氨酸脱羧酶(GadB)/删除C末端11个氨基酸的GadB(GadB△C11)和氨基酸转运载体(GadC)，通过谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成γ‑氨基丁酸，再通过氨基转运载体把γ‑氨基丁酸转运到胞外，在此过程中消耗一个质子，中和酸的压力，提高产琥珀酸放线菌的耐酸能力，从而降低发酵过程pH调节剂用量。

[0006]本发明的第一个目的是提供一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌是在产琥珀酸放线杆菌中过表达谷氨酸脱羧酶GadB和氨基酸转运载体GadC。

[0007]进一步地，所述的谷氨酸脱羧酶GadB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。[0008]进一步地，所述的氨基酸转运载体GadC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。[0009]进一步地，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌中，所述的谷氨酸脱羧酶GadB还

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包括删除C末端的11个氨基酸的谷氨酸脱羧酶GadB。[0010]进一步地，编码所述的谷氨酸脱羧酶GadB的基因或编码删除C末端的11个氨基酸的谷氨酸脱羧酶GadB的基因，与编码所述的氨基酸转运载体GadC的基因之间还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的RBS片段。[0011]进一步地，编码所述的谷氨酸脱羧酶GadB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述的氨基酸转运载体GadC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。[0012]进一步地，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌是以产琥珀酸放线杆菌ATCC 55618、产琥珀酸放线杆菌CGMCC NO.1593、产琥珀酸放线杆菌CCTCC NO：M 2012036、产琥珀酸放线杆菌CGMCC NO.1716或产琥珀酸放线杆菌CCTCC M2011399为宿主菌。[0013]进一步地，所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌是以pLGZ922作为表达载体。为商业购买得到。

[0014]本发明的第二个目的是提供所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：[0015](1)重组质粒构建：将采用RBS连接的谷氨酸脱羧酶基因gadB与氨基酸转运载体基因gadC，与表达载体pLGZ922连接在一起，获得过表达载体gadB‑gadC‑pLGZ922；[0016](2)基因工程菌制备：将过表达载体gadB‑gadC‑pLGZ922转入宿主菌中，筛选获得所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌。

[0017]本发明的第三个目的是提供所述的产琥珀酸放线杆菌基因工程菌在发酵生产琥珀酸中的应用。

[0018]本发明的有益效果是：

[0019]本发明通过在产琥珀酸放线菌中过表达谷氨酸脱羧酶(GadB/GadB△C11)和氨基酸转运载体(GadC)，通过谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成γ‑氨基丁酸，再通过氨基转运载体把γ‑氨基丁酸转运到胞外，在此过程中消耗一个质子，中和酸的压力，提高产琥珀酸放线菌的耐酸能力，从而降低发酵过程pH调节剂用量和副产物乙酸的生成。附图说明

[0020]图1是Gad系统的主要结构及作用示意图；[0021]图2是gadB‑gadC‑pLGZ922过表达质粒图谱；[0022]图3是谷氨酸脱羧酶活性测定结果；其中，1：底物缓冲液对照，2：WS058反应液，3：pLGZ922‑WS058反应液，4：gadB‑gadC‑WS058反应液5：gadB△C11‑gadC‑WS058反应液；[0023]图4是耐酸性实验测定结果。

具体实施方式

[0024]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以

但所举实施例不作为对本发明的限定。更好地理解本发明并能予以实施，

[0025]实施例中以产琥珀酸放线杆菌CGMCC NO.1593为例，命名为WS058。[0026]实施例1：过表达菌株gadB‑WS058、gadB‑gadC‑WS058和gadB△C11‑gadC‑WS058的构建

[0027]本实施例具体说明过表达菌株gadB‑WS058、gadB‑gadC‑WS058和gadB△C11‑gadC‑

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WS058的构建过程，具体步骤如下：

[0028]使用Ezvp柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取实验室保存的布氏乳杆菌的基因组，并以其为模板，分别使用gadB基因引物(F1和F2)/gadB△C11(F1和F5)和gadC基因引物(F3和F4)PCR扩增出gadB和gadC/gadB△C11片段，其中gadB/gadB△C11和gadC基因片段的大小分别为1449bp和1521bp左右，随后使用引物F1和F4通过融合PCR扩增出gadB‑gadC/gadB△C11‑gadC片段，其大小为2979bp左右，获得Gad系统基因表达盒。[0029]引物序列(SEQ ID NO.7～11)：[0030]F1：TTATCAATGAGGTGATCTAGAATGAGTGAAAAAAATGATGAACAGATG[0031]F2：AACTTCACCTTTATTTATTGCTGACCGTTGTTGCGTCTG[0032]F3：CAATAAATAAAGGTGAAGTTTGGAAAGAGACGACGTTGAATCTCATG[0033]F4：ACGGCCAGTGAATTCGAGCTCCTACTTTTTAGCAGTTTCTCCATGCG[0034]F5：AACTTCACCTTTATGAAGGAATATTGTATTCCAATTCGT[0035]利用一步克隆将gadB‑gadC/gadB△C11‑gadC片段分别与载体pLGZ922连接在一起从而构建gadB‑gadC‑pLGZ922/gadB△C11‑gadC‑pLGZ922过表达质粒，然后将重组质粒转入到大肠杆菌JM109中，通过抗性平板(Amp)筛选正确的阳性转化子并测序验证，得到大量gadB‑gadC‑pLGZ922/gadB△C11‑gadC‑pLGZ922过表达质粒。通过电击转化法分别将测序正确的过表达质粒转入目的菌株琥珀酸放线杆菌WS058中，在抗生素平板上筛选的阳性单克隆，提取基因组进行PCR验证并测序，获得含有Gad系统的重组菌株。图2是构建的gadB‑gadC‑pLGZ922/gadB△C11‑gadC‑pLGZ922过表达质粒示意图。[0036]实施例2：Gad系统在产琥珀酸放线杆菌中的酶活测定

[0037]本实施例具体说明Gad系统引入到产琥珀酸放线杆菌中后是否有酶的活性，具体测定方法如下：

[0038]从冰箱中取出甘保藏的菌种WS058、pLGZ922‑WS058、gadB△C11‑gadC‑WS058、gadB‑gadC‑WS058，常温融化后(取750μL)接入TSB液体(50ml/100ml)培养基，37℃厌氧培养30h。

[0039]将培养好的菌液4℃6000rpm离心10min，收集菌体，水洗一遍，加入10mL蒸馏水，悬浮菌体，获得样品溶液。

[0040]将0.2mol·L‑1乙酸钠‑乙酸缓冲液(pH 4.6)作为反应缓冲液，加入60mM谷氨酸钠和0.6mM磷酸吡哆醛配制成底物缓冲液。将1mL底物溶液与2mL样品溶液混合，置30℃水浴锅中反应12h后，离心取上清作为样品溶液。[0041]纸层析检测产物：按配好的展开剂置于层析缸中，使其充分饱和，剪裁合适大小的层析纸，用1μL点样针将样品点在层析纸上点样过程中边点样边用吹风机吹干，使斑点直径控制在2mm以内。将层析纸放入层析缸中，展开剂在层析纸上充分展开(距离上边缘2cm)时，取出层析纸，放干燥箱中80℃烘干，均匀加显色剂显色，放干燥箱中烘干至出现紫色斑点。[0042]在本实施例中发现外源引入gadB‑gadC到产琥珀酸放线杆菌中，可使产琥珀酸放线杆菌具有谷氨酸脱羧酶的活性，gadB△C11‑gadC‑WS058、gadB‑gadC‑WS058能在pH 4.6把谷氨酸转化成γ‑氨基丁酸，且把γ‑氨基丁酸转运到细胞外(图3)。[0043]实施例3：耐酸能力的测定

[0044]本实施例具体说明产琥珀酸放线杆菌引入Gad系统后对菌株耐酸能力的影响，具

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体测定方法如下：

[0045]从冰箱中取出甘保藏的菌种，常温融化后划线活化，挑取单菌落至TSB培养基中37℃厌氧培养24h；后吸取30mL菌液分别加入到含50mL离心管中,8000rpm离心10min，弃上清，加入30mL无菌水悬浮菌体，后分别吸取5mL加入含有45mL pH 4.6的不同谷氨酸钠浓度的TSB培养基中，37℃厌氧培养至1.5h。吸取1mL，水洗一遍，并按一定的比例稀释，后吸取5μL点于TSB平板上，37℃厌氧培养24h后观察。

[0046]在本实施例中含有Gad系统的产琥珀酸放线杆菌在pH4.6条件下，存活的菌落数大约是野生型的3.5倍，从而说明了引入Gad系统后的产琥珀酸放线杆菌的耐酸能力明显提高，存活率提高3.5倍。(图4)。

[0047]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

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序　列　表

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序列表<110> 江南大学<120> 一种产琥珀酸放线杆菌基因工程菌及其构建方法与应用<160> 11<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 482<212> PRT<213> （人工序列）<400> 1

 Met Ile Asp Glu Ile Gly Leu GluMet Ser Glu Lys Asn Asp Glu Gln

1  5  10  15 Asn Phe Leu Gly Ser Val Glu Ala Gly Lys Ser Leu Pro Thr GluGln

20  25  30Glu Leu Pro Glu His Pro Met Pro Ala Ser Ile Ala Ala Gln Leu Val 35  40  45Gln His Tyr Arg Leu Asn Glu Ala Lys Ala Asn Gln Asn Leu Ala Thr  50  55  60Phe Cys Thr Thr Gln Met Glu Pro Glu Ala Asp Lys Leu Met Thr Asp65  70  75  80Ala Leu Asn Thr Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Lys Thr Ala 85  90  95Ala Met Glu Asn Tyr Cys Val Ser Met Leu Ala His Leu Trp Gly Ile 100  105  110Pro Lys Gly Lys Lys Met Tyr Lys Asp Phe Ile Gly Thr Ser Thr Val 115  120  125Gly Ser Ser Glu Gly Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Leu Leu Ser 130  135  140Trp Lys His Arg Ala Glu Lys Ala Gly Phe Asp Thr Lys Asp Leu His145  150  155  160His His Leu Pro Asn Leu Val Ile Met Ser Gly Tyr Gln Val Val Trp 165  170  175Glu Lys Phe Cys Thr Tyr Trp Asn Val Glu Leu Arg Gln Val Pro Ile 180  185  190Asp Gln Asn His Met Ser Met Asp Met Asp His Val Met Asp Tyr Val 195  200  205Asp Glu Asn Thr Ile Gly Ile Val Gly Ile Gln Gly Ile Thr Tyr Thr 210  215  220

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序　列　表

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Gly Ala Val Asp Asp Ile Gln Lys Leu Asp Arg Leu Val Ser Glu Tyr225  230  235  240Asn Lys Thr Ala Val Leu Pro Ile Arg Ile His Val Asp Ser Ala Phe 245  250  255Gly Gly Leu Phe Ala Pro Phe Val Asp Gly Phe Lys Pro Trp Asp Phe 260  265  270Arg Leu Lys Asn Val Val Ser Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly 275  280  285Met Val Tyr Pro Gly Ile Gly Trp Ile Val Trp Arg Asn Asn Ser Glu 290  295  300

 Phe Ser Val Pro Tyr Leu Gly SerAsp Leu Leu Pro Lys Glu Met Arg

305  310  315  320

 Ala Ile Asn Phe Ser His Ser Gly Ala His IleSer Val Asp Ser Ile

325  330  335Val Gly Gln Tyr Tyr Asn Phe Val Arg Phe Gly Tyr Lys Gly Tyr Glu 340  345  350Ala Ile Met Asn Asn Val Arg Lys Val Ser Leu Arg Ile Thr Glu Glu 355  360  365Leu Lys Lys Phe Gly Ile Phe Glu Ile Leu Asn Asp Gly Ser Gln Leu 370  375  380Pro Ile Asn Cys Trp Lys Leu Ala Asp Asp Ala Lys Val Asp Trp Thr385  390  395  400Leu Tyr Asp Leu Glu Gly Glu Leu Ala Lys Tyr Gly Trp Gln Val Pro 405  410  415Ala Tyr Pro Leu Pro Lys Asn Arg Glu Asp Thr Thr Ile Ser Arg Ile 420  425  430Val Val Arg Pro Ser Met Thr Met Thr Ile Leu Asp Asp Phe Met Glu 435  440  445Asp Leu Lys Met Ala Ile His Asn Leu Asn Lys Glu His Gly Asn Asn 450  455  460Glu Leu Glu Tyr Asn Ile Pro Ser Ala Ala Asp Ala Thr Thr Val Ser465  470  475  480Asn Lys<210> 2

 506<211><212> PRT<213> （人工序列）<400> 2Leu Glu Arg Asp Asp Val Glu Ser His Ala Glu Ser Ile Lys Asn Ala

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1  5  10  15Asn Gln Ile Thr Gly Phe Gln Leu Phe Ser Met Thr Thr Ser Met Val 20  25  30Met Thr Val Tyr Gly Phe Ala Ala Phe Ala Lys Gln Gly Pro Thr Ala 35  40  45Leu Phe Phe Leu Phe Leu Ala Gly Ile Leu Trp Phe Ile Pro Val Thr 50  55  60Lys Ala Ala Gly Glu Met Ala Ser Ile Asp Gly Trp Ser Arg Gly Gly65  70  75  80Ile Phe Thr Trp Ala Arg Asn Met Leu Gly Glu Lys Thr Gly Trp Ala

  90  95 85

Ala Leu Phe Tyr Gln Trp Val His Ile Thr Val Gly Met Asn Thr Met

  105  110 100

Met Tyr Phe Ile Ile Gly Cys Leu Ser Ile Ser Val Gly Leu Pro Ile 115  120  125Met Asn Asp Asn Pro Phe Val Lys Phe Gly Leu Met Met Val Ile Leu 130  135  140Trp Gly Leu Ile Leu Val Gln Gln Arg Gly Thr Lys Leu Thr Gly Lys145  150  155  160Ile Ala Gln Trp Cys Phe Thr Leu Gly Val Ile Ile Pro Val Phe Phe 165  170  175Leu Leu Ala Ile Phe Ile Ile Tyr Leu Ala Gln Gly Asn Pro Met Leu 180  185  190Ile Asn Ile Asn Phe His Ser Ile Leu Pro Ser Ser Trp Ser Gly Asp 195  200  205Val Leu Val Gly Phe Val Pro Phe Met Leu Ala Phe Ala Gly Ala Glu 210  215  220Gly Ser Ala Pro His Val Lys Asp Leu Asp His Pro Arg Val Tyr Pro225  230  235  240Lys Val Met Leu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ile Val Ser Asp Ile Val 245  250  255Gly Ser Met Ala Ile Ala Gly Thr Ile Pro Asn Lys Asp Ile Gln Leu 260  265  270Ser Thr Gly Ile Val Tyr Ala Tyr Gly Ala Leu Val Gln Lys Phe Gly 275  280  285Ile Ser Val Val Ile Val Glu Lys Leu Ser Gly Phe Leu Leu Ala Val 290  295  300Gly Val Leu Gly Glu Ile Ser Ser Trp Val Val Gly Pro Asn Ala Gly305  310  315  320

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序　列　表

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Met Phe Glu Ala Ala Lys Ser Gly Phe Leu Pro Pro Arg Phe Ser Lys 325  330  335Ala Asn Lys Tyr Gly Val Glu Thr Asn Val Met Ile Leu Gln Gly Ile 340  345  350Ile Val Ser Ile Met Gly Ala Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Gly Ser 355  360  365Lys Ala Asn Leu Ser Phe Gln Thr Ala Met Ser Leu Thr Val Ala Leu 370  375  380Tyr Thr Leu Met Tyr Met Leu Leu Phe Ile Ser Tyr Met Val Leu Gln385  390  395  400 Lys His Ser Asp Leu Asn Arg Pro Tyr Val Ala Ser Lys Ser LysIle

405  410  415

 Leu Val Tyr Gly Gly Leu Gly Phe Ile Leu Ser Ala PheVal Met Arg

420  425  430Gly Phe Phe Val Thr Phe Phe Pro Pro Lys Asp Met Ile Ala Ser Ser 435  440  445Gln Arg Thr Tyr Leu Thr Leu Leu Leu Thr Gly Phe Val Val Val Phe 450  455  460Phe Ile Pro Phe Ile Leu Tyr Arg Tyr His Lys Arg Trp Ala Asn Glu465  470  475  480Leu Gly Leu Pro Ala Glu Glu Thr Glu Lys Pro Thr Val Val Ile Thr 485  490  495Pro Gln Ala His Gly Glu Thr Ala Lys Lys 500  505<210> 3<211> 1449<212> DNA<213> （人工序列）<400> 3atgagtgaaa aaaatgatga acagatgatt gatgaaattg gtcttgaaca gaacttctta 60ggaagtgttg aagctggtaa atcattgcca actgaagagt tgccagagca tccaatgcca 120gctagcattg ctgcccaact tgtccagcat tatcggctga atgaagctaa agctaatcaa 180aacctggcaa cgttctgtac aacacagatg gagccagaag ccgataagct tatgacagat 240gctcttaata cgaatgcaat tgataagtct gaatatccta agacagctgc aatggaaaat 300tactgtgtaa gcatgttggc tcacttatgg gggatcccta agggcaagaa gatgtacaaa 360gatttcattg gaacatcgac tgtgggatct tcagaaggtt gcatgcttgg gggactgtca 420ctgctgttga gctggaaaca tcgtgcggaa aaggccggct ttgatacgaa agatcttcat 480catcatcttc caaatctagt tattatgtca ggttatcaag ttgtttggga aaaattctgc 0acttactgga atgtcgaact tcgacaggtt ccaattgatc agaaccatat gtctatggac 600

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序　列　表

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序　列　表

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序　列　表

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

图4

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