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蓝莓花青素、多酚类物质的分离纯化与生物活性研究

来源：钮旅网

蓝莓花青素、多酚类物质的分离纯化与

生物活性研究

Investigation on Separation,

Purification and Biological Activity of Anthocyanins and Polyphenols in Blueberry

学科专业：食品科学研究生：李兴元指导教师：寇晓虹副教授

天津大学化学工程学院二零一二年十一月

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

学位论文作者签名：签字日期：年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。

（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）

学位论文作者签名：导师签名：

签字日期：年月日签字日期：年月日

摘要

本文选择蓝莓中花青素和多酚类化合物两类活性物质进行研究，以不同的提取工艺对两者进行提取，采用AB-孔吸附树脂纯化粗提物，共获得蓝莓花青素粗提物、多酚粗提物、花青素纯化物和多酚纯化物四种物质。进行了体外抗氧化、体外抗肿瘤、体内抗肿瘤和免疫功能研究。

通过总还原能力检测（FRAP）、清除DPPH和ABTS自由基三种方法对四种提取物进行了抗氧化性比较，发现纯化后的花青素和多酚类物质的抗氧化活性显著提高（P<0.05），同时在相同浓度下花青素抗氧化活性高于多酚类化合物。

采用MTT法进行体外抑制乳腺癌细胞（MDA-MB 231）增殖能力的分析，结果表明，四种提取物对MDA-MB 231细胞具有明显的抑制作用，在实验选取浓度范围内呈现出明显的剂量效应关系，花青素和多酚粗提物抑制肿瘤增殖能力较强（P<0.05）。两种纯化物体外抑制肿瘤增殖的能力较低，这与体外抗氧化分析结果不同。

在体外细胞实验基础上，以环磷酰胺为阳性对照，应用四种提取物对乳腺癌CD-1小鼠模型进行抗肿瘤实验。结果表明，三个剂量组的四种提取物对肿瘤抑制能力虽然低于环磷酰胺药物组，但均具有一定程度的抑制作用。同时显著提高小鼠体重、胸腺和脾脏指数、巨噬细胞吞噬能力、脾淋巴细胞转化能力和体内SOD活性（P<0.05），减少肝组织MDA 和血清NO 的积累，其中多酚和花青素粗提物混合物效果最好，说明蓝莓提取物在有效抑制肿瘤增长的同时能显著提高小鼠的免疫功能和身体机能。

应用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS），对纯化后蓝莓花青素和多酚类化合物进行物质组成和结构的分析，发现在花青素中主要含有天竺葵素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷和锦葵色素-3-O-葡萄糖等花色苷，在多酚类物质中主要含有槲皮素-3-O-半乳糖苷和表儿茶素等物质。在这些化合物中，大部分物质含有3-O-己糖或戊糖苷这种结构。

研究结果为综合评价蓝莓花青素和多酚活性，揭示其抗肿瘤机制奠定理论基础。

关键词：蓝莓花青素多酚类物质分离纯化生物活性抗肿瘤

ABSTRACT

Blueberry anthocyanins and polyphenols were chosen as research objects. Different extraction processes were taken to separate the two materials. AB-8 macroporous resin was used to pure blueberry anthocyanins and polyphenols crude extracts. At last, four kinds of blueberry extracts, blueberry anthocyanins crude extract, polyphenols crude extract, purified anthocyanins and purified polyphenols were obtained. Studies of the four extracts on vitro antioxidant, anti-tumor in vitro, anti-tumor in vivo and immune function were carried out.

Three methods, ferric reducing antioxidant power (FRAP), the DPPH method and abts radical scavenging activity (ABTS), were taken to compare antioxidant activity of the four extracts. The results showed that, the antioxidant activity of purified anthocyanins and polyphenols are significantly increased (P<0.05). Anthocyanins extracts have higher antioxidant activity than polyphenols.

MTT assay was used to analysis the inhibiting abilities of the four extracts on breast cancer cells (MDA-MB 231) in vitro. Results showed that the improvement of the antioxidant capacity of the two purified product did not improve their abilities to inhibit tumor proliferation in vitro, on the contrary, anthocyanins and polyphenols crude extract had higher ability of inhibiting tumor proliferation (P <0.05).

Based on vitro experiments results and with cyclophosphamide as positive control, the four extracts were applied to do anti-tumor experiment of CD-1 breast cancer model mouse. The results showed that the four extracts of the three dose groups of tumor suppression capability although lower than positive control, but all have certain degree of inhibition. They can also significantly improve indicators of tumor suppression, body weight, thymus & spleen index, macrophages phagocytosis and lymphocyte transformation capacity and SOD activity (P <0.05), and greatly reduce the accumulation of MDA in lung and liver and NO in serum (P <0.05). Polyphenols and anthocyanins crude extract mixture works best. So the blueberry extracts can inhibit tumor growth effectively, while protect mice bodily functions.

Material composition and structure analysis of purified blueberry anthocyanins and phenolic compounds were carried out though high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS). Found that, in anthocyanins mainly contain pelargonidin-3-O-anthocyanin galactoside, quercetin-3-O-galactoside and

mallow pigment-3-O-glucose, etc. In polyphenols mainly contain

quercetin-3-O-galactoside and epicatechin and other substances. In these compounds, majority contains of the 3-O-hexose or pentose glycoside structure.

The findings lay the theoretical foundation for a comprehensive evaluation of blueberry anthocyanins and polyphenols activity and reveal their anti-tumor mechanism.

KEY WORDS：Blueberries, Anthocyanin, Polyphenols, Separation and

purification, Biological activity, Antitumor

第一章文献综述.......................................................................................................... 1

1.1蓝莓简介.......................................................................................................... 1

1.1.1 农业中的蓝莓...................................................................................... 1 1.1.2 工业中的蓝莓...................................................................................... 1 1.1.3 蓝莓的功能.......................................................................................... 2 1.2 蓝莓果实中重要功能成分............................................................................. 2

1.2.1维生素................................................................................................... 2 1.2.2蓝莓果实中的果胶成分 ...................................................................... 3 1.2.3蓝莓果实中的多酚类化合物 .............................................................. 3 1.2.4蓝莓果实中的花青苷色素 .................................................................. 3 1.3花青素研究进展.............................................................................................. 4

1.3.1花青素概述........................................................................................... 4 1.3.2花青素功能研究进展........................................................................... 5 1.4多酚类物质研究进展...................................................................................... 6

1.4.1多酚类物质概述................................................................................... 6 1.5研究背景、目的和意义.................................................................................. 7

1.5.1 研究背景及意义.................................................................................. 7 1.5.2 研究内容.............................................................................................. 8

第二章蓝莓花青素、多酚类化合物的纯化及抗氧化活性测定............................ 10

2.1实验材料........................................................................................................ 10

2.1.1实验仪器............................................................................................. 10 2.1.2 主要试剂............................................................................................ 10 2.2 试验方法....................................................................................................... 11

2.2.1蓝莓花青素、多酚类化合物粗提物的制备 .................................... 11 2.2.2蓝莓花青素及多酚类化合物纯化品的制备 .................................... 12 2.2.3蓝莓花青素、多酚类物质抗氧化活性测定 .................................... 13 2.3 结果与分析................................................................................................... 14

2.3.1 蓝莓花青素、多酚类物质的纯化 ................................................... 14 2.3.1蓝莓花青素、多酚类物质还原能力 ................................................ 15 2.3.2蓝莓花青素、多酚类物质清除ABTS自由基能力 .......................... 16 2.3.3 蓝莓花青素、多酚类物质的DPPH自由基清除能力 .................... 17 2.4 小结............................................................................................................... 17 第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用研究................ 19

3.1实验材料........................................................................................................ 19

3.1.1 药物和试剂........................................................................................ 19 3.1.2 实验器材............................................................................................ 19 3.2 试验方法....................................................................................................... 20

3.2.1细胞培养............................................................................................. 20 3.2.2细胞计数............................................................................................. 20 3.2.3 MTT实验法 ........................................................................................ 21 3.3 结果与讨论................................................................................................... 21

3.3.1四种提取物作用下MDA-MB-231细胞增殖率 ................................ 21 3.3.2花青素粗提物与纯化物作用下MDA-MB-231细胞增殖率 ............ 22 3.3.3多酚类物质粗提物与纯化物作用下MDA-MB-231细胞增殖率 .... 22 3.3.4花青素与多酚类物质粗提物作用下MDA-MB-231细胞增殖率 .... 23 3.3.5花青素与多酚类物质纯化物作用下MDA-MB-231细胞增殖率 .... 24 3.4 小结............................................................................................................... 24 第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性................................................ 26

4.1 实验材料....................................................................................................... 26

4.1.1 药品和试剂........................................................................................ 26 4.1.2 实验器材............................................................................................ 26 4.1.3实验用动物及癌细胞......................................................................... 27 4.1.4实验用溶液......................................................................................... 27 4.2 试验方法....................................................................................................... 27

4.2.1 试验组的设置.................................................................................... 27 4.2.2 建模方法............................................................................................ 28 4.2.3 肿瘤抑制实验.................................................................................... 29 4.2.4迟发型超敏反应（DTH）.................................................................. 29 4.2.5巨噬细胞吞噬实验（碳粒廓清实验） ............................................ 29 4.2.6 MTT法淋巴细胞转化实验 ................................................................ 29 4.2.7肿瘤组织形态观察............................................................................. 29 4.2.8肝脏及肺部组织中SOD、MDA含量的测定 ................................... 29 4.2.9血清中NO含量的测定 ..................................................................... 30 4.3结果与讨论.................................................................................................... 30

4.3.1小鼠外观表现观察............................................................................. 30 4.3.2实验过程中小鼠肿瘤生长变化 ........................................................ 32 4.3.3 蓝莓花青素、多酚类物质对Balb/c乳腺癌小鼠的抑瘤作用和对免疫器官的影响.............................................................................................. 32 4.3.4 蓝莓花青素、多酚类物质对Balb/c乳腺癌小鼠迟发型超敏反应的影响.............................................................................................................. 33 4.3.5小鼠脾淋巴细胞转化能力 ................................................................ 34 4.3.6碳粒廓清实验（小鼠巨噬细胞吞噬能力测定） ............................ 35 4.3.7小鼠肝部、肺部组织中SOD活力及MDA含量 ............................. 36 4.3.8 小鼠血清一氧化氮含量 ................................................................... 38 4.3.9 小鼠肺部、肝部组织HE染色 ......................................................... 40 4.4 小结............................................................................................................... 42 第五章蓝莓花青素及多酚类物质中主要成分分析................................................ 45

5.1 实验材料....................................................................................................... 45

5.1.1 药品和试剂........................................................................................ 45

5.1.2 实验仪器............................................................................................ 45 5.2 试验方法....................................................................................................... 46

5.2.1 高效液相色谱及液相色谱-质谱联用技术 ...................................... 46 5.2.2 液质联用分析用蓝莓花青素及多酚类化合物的制备 ................... 46 5.2.3 蓝莓花青素及多酚类化合物液相分析条件 ................................... 46 5.2.4质谱条件............................................................................................. 48 5.3 一级质谱对蓝莓花青素解析....................................................................... 48 5.4 一级质谱对蓝莓多酚类化合物的解析....................................................... 48 5.5 小结............................................................................................................... 49 第六章全文总结及展望............................................................................................ 51

6.1全文总结........................................................................................................ 51 6.2 展望............................................................................................................... 51 参考文献...................................................................................................................... 52 发表论文和科研情况说明.......................................................................................... 57 附录.............................................................................................................................. 58 致谢.............................................................................................................................. 73

第一章文献综述

1.1蓝莓简介

蓝莓主产区在北美，有蓝色浆果之意。学名又称为越橘，杜鹃花科越橘属[1]。全世界范围内大约有400种左右的越橘属植物。蓝莓属于多年生绿叶或是常绿灌木，时至今日，蓝莓的栽培史也不到100年。因为其具有很高的营养和保健价值而流行世界，是联合国粮农组织（FAO）评选出的人类五大健康食品之一[2]，同样冠有“黄金水果”的美名。

1.1.1 农业中的蓝莓

目前越橘属植物在全世界范围内种植，美国是其主产国。在我国南北方均有野生资源分布，但地点较为集中，南方主要分布在云南和江浙，北方主要分布在山东及东北三省。目前在国内栽培的蓝莓品种主要有高丛、矮丛和兔眼[3]三大种类，因此，我国农业在蓝莓种植面积和种类上都有很大的提升和完善空间。

1.1.2 工业中的蓝莓

蓝莓可食率100 %，而且风味独特、香甜可口。不仅非常适于新鲜食用，同时也适用于工业生产，加工成蓝莓食品或者作为其他食品辅料。统计显示，在我国蓝莓鲜果约有70%是直接销售的，其中大部分作为价格低廉的原料出口国外。另外30%中大部分作为原料冷冻果进行处理[4]，因此，我国的蓝莓鲜果深加工量还较小。

蓝莓鲜果的加工品一方面可以解决蓝莓鲜果储存期短和果实利用率较低的弊端[5]，加强市场的供应能力，延长蓝莓产品企业的生产链[6]，另一方面也可以满足消费者周年对蓝莓鲜果[7]的需求。

目前在我国市场销售的蓝莓产品仅有不到十大类，产品类型涉及食品类如果汁饮料类、罐头和果酱类[8]；医药类如眼保健产品和健康饮品；美容类产品等；食用色素类产品是蓝莓新兴产品，发展迅速，目前得到越来越多的重视，同时有一些具影响力的蓝莓色素企业相继上市；同时蓝莓生理活性成分提取的深加工也成为一些企业关注的重要方面。

从我国整个蓝莓工业产品加工行业来看，大部分企业的加工设备普遍落后，原料利用率偏低，产品品质与国际高端产品相差较大，在市场上的竞争上，我国

第一章文献综述

产品在价格和品质上的竞争力都明显不足，卖点仅仅是各个企业普遍应用的“健康”，在产品定位、工艺特色和包装上缺乏创意。总之，我国的蓝莓产业应尽快改变定位于中低端产品的思路，大力发展自己的蓝莓产品品牌。

1.1.3 蓝莓的功能

蓝莓全果呈深蓝色，成熟时外表会形成一层白色果粉，非常美观。不仅风味独特，酸甜兼备，而且果肉细腻，营养丰富[9]。

蓝莓果实不仅含有糖、酸、VC和蛋白质等常见的营养物质外[10]，还富含维生素A、B和E、超氧化歧化酶（SOD）、熊果苷、花青苷和食用纤维等可以改善人体生理功能的物质。蓝莓果实也含有丰富的K、Fe、Zn、Ca等对人体有重要作用的矿物质元素[11]。同时，在部分营养物质的含量上，如花青素、有机锗、硒、熊果苷等，高于其他水果和蔬菜 [12]。

我国中医学中也对蓝莓的医药功能有所记载：蓝莓果有治肠炎、去胃火、驱毒及滋阴补肾之功效[13]。

近些年来关于蓝莓生理功能方面的研究主要集中在蓝莓中含有的大量的抗氧化成分。许多研究表明蓝莓中抗氧化物质含量丰富在人体内能有效地抑制氧自由基的生存[14]，从而起到提高人体免疫能力，预防和延缓人体衰老，增强记忆力的作用[15]。

1.2 蓝莓果实中重要功能成分 1.2.1维生素

蓝莓果实中维生素不仅种类齐全而且含量丰富，主要包括维生素E、维生素C和维生素A，与其他水果如苹果和葡萄等相比，蓝莓中维生素的含量高出几倍甚至几十倍。因此经常食用蓝莓，可以充分满足人体对维生素的需求。

而这三种主要的维生素中，维生素E的含量之高尤为突出。维生素E是一种脂溶性维生素[16]，在人体内有很强的清除氧自由基的能力。维生素E不能由人体自身合成，从外界摄取成为唯一补充维生素E的途径。由于维生素E抗氧化能力强，自然状态下不易稳定存在，而且在提取和精炼处理过程中会遭到很大破坏。因此，食用含有维生素E含量较高的植物性食物进行补充，显得非常重要。

第一章文献综述

1.2.2蓝莓果实中的果胶成分

蓝莓果实中果胶的含量也十分丰富，每1Kg新鲜果实中的果胶含量可达到4g，比香蕉等果实中含量高出2倍。果胶存在于植物的细胞壁和细胞内层，在细胞中起支撑物的作用 [17]。果胶属于水溶性膳食纤维，不被人体内的酶分解，只能被大肠内一些特殊微生物产生的酶分解[18]。

果胶可以改善人体内胆固醇聚集，进而减少冠状动脉硬化和心脏病的发病率

[19]

。果胶还可以调节餐后体内血糖水平以及人体肠道微生态的平衡，被科学家称

为人体健康平衡素。科学研究还发现果胶可以有效地预防和辅助治疗心脑血管疾病、糖尿病和肥胖等多种 “富贵病”[20]。

1.2.3蓝莓果实中的多酚类化合物

多酚类物质是指分子中具有多个酚羟基的植物酚类，通常具有很强的抗病毒、抑制体内氧自由基等作用[21]。

蓝莓果实含有丰富的天然多酚类化合物，一般100g新鲜蓝莓含有的多酚类化合物约为150 mg。植物多酚类物质具有很强的抗氧化能力，是相同剂量下维生素C抗氧化能力的20倍[22]，因此可有效地清除人体内的氧自由基，从而减少氧自由基对正常细胞的破坏，起到保护作用。同时多酚类化合物还可以预防潜在的致癌性物质在人体内的形成和聚集，防癌作用显著。因此，经常食用蓝莓，可以预防动脉硬化和癌症的发生，增强人体活力，改善新陈代谢[23]。

蓝莓果实中一些特殊结构的多酚类物质具有某些特殊的功效，例如Toufexis[24]的研究表明，蓝莓中的叶酸可以抑制促进癌细胞急速增殖的酶的活性，可以减缓癌症的扩散，并对胎儿的发育有很大的益处；蓝莓中的没食子酸对体外培养的肝癌细胞增殖能力具有显著抑制作用。

1.2.4蓝莓果实中的花青苷色素

蓝莓花青素(Anthocyanosides)是天然的抗衰老保健品。相关研究显示蓝莓花青素是迄今发现的效果最好的植物抗氧化剂，食用蓝莓果实可以有效的调节人体机能，改善人体内部抗氧化环境，提高机体免疫能力 [25]。其中，蓝莓花青素在改善视力功能上的开发尤其充分，目前已有多种蓝莓花青素提取物制剂出现在市场上，普遍反映改善视力的效果明显。

蓝莓花青素提取物所含成分特点鲜明，大部分的花青素成分是低聚体，这种结构不仅易于人体的吸收，同时还可以较容易地扩散到人体血液和脑细胞中，保护这些精细细胞。尤其是占大多数的原花青素二聚体以及三聚体对体内氧自由基

第一章文献综述

的清除效果最为显著。有研究证明，这些原花青素低聚体对过氧化氢的抑制率最高可达到40%，表现出优秀的还原能力。

同时，蓝莓中含有丰富的矿物质元素、氨基酸、有机硒和维生素等营养成分，这些特殊营养物质在游离状态就能对人体产生有益的生理功效。在有原花青素低聚体存在的情况下，这些特殊的营养物质就能结合到花青素低聚体分子中，可以很大程度上提高这些营养物质的生物利用率。

蓝莓果实内天然色素的含量较高，花色素苷含量远远超过其他植物许多倍，目前市场上已有一些蓝莓花青素口服制剂，这些制剂正是利用了蓝莓花青素属是水溶性的小分子，容易被人体吸收的特点。

1.3花青素研究进展 1.3.1花青素概述

花青素又称花色素，是自然界中广泛存在的一种水溶性天然植物色素，是类黄酮化合物[26]。花青素是植物花瓣和果实中主要的呈色物质，其颜色随着环境和细胞液pH值的改变而改变。例如细胞液呈酸性时，花青素颜色偏红[27]；而细胞液呈碱性时，偏蓝色，这正是大自然中的水果，蔬菜，花卉等呈现五颜六色的原因[28]。

花青素是一种次级代谢产物，在植物自身生理功能上也起着十分重要的作用，例如花瓣美丽的颜色能够吸引蜜蜂对植物进行授粉；果实的特殊颜色能够吸引一些昆虫帮助植物进行种子传播[29]。在购买蔬菜或水果时，消费者也会按照果实的颜色来进行果实价格的定位，其颜色的深浅和明亮程度正与花青素的含量密切相关。因此各种影响花青素合成的因素也是农业生产中应多加利用或避免的，比如光照、低温、氧气浓度和各种矿物元素的施加等。

花青素在食品工业上的应用日益受到关注。目前食品生产上应用的色素添加剂绝大多数为化学合成，它们在不同程度上对人体具有毒性，长期食用会对人体健康产生不利的影响，因此对花青素这种天然色素的研究和开发就显得尤为迫切。但由于技术上的，至今国内还没有企业具备大规模生产花青素纯品制剂的能力，因此目前补充花青素的有效方式是通过饮食，例如食用蓝莓、紫甘薯、甘蓝、紫玉米等蔬菜或水果。另一方面，要想深入研究开发花青素的功能保健品必须以花青素纯品为最终的生产对象，因此，一套完整有效的大规模生产花青素的工艺流程和机械设备亟待开发。

目前已经投入商业生产的色素主要有葡萄皮色素、紫甘薯等。而花青素粗品

第一章文献综述

主要应用于食品风味的添加配料或者食用色素在果酒中应用。

其他具有开发利用前景的花青素有山棘色素、草莓红素和牵牛花红素等。花青素的基本结构单元又称为花色基元，是由一个3碳结构连接两个苯环形成的阳离子。目现已知的花青素有20多种，存在于植物中的主要有：翠雀素、天竺葵素、芍药素、锦葵素、牵牛红素及车矢菊色素[30]。在自然条件下以游离状态存在的花青素极少见，花青素主要与一个或多个葡萄糖、己糖和阿拉伯糖等结合形成花色苷，以糖苷的形式存在。

花青素广泛存在于多种深红色、紫色和蓝色的蔬菜和水果中，比如蓝莓、山棘、紫甘薯、辣椒、紫甘蓝、桑葚[31]、番茄等植物的各个组织中，在这些蔬菜和水果中提取出来的花青素色彩明亮，营养丰富，在很多方面都可以应用，非常具有开发价值。

1.3.2花青素功能研究进展

花青素生理功能和多种保健作用，得到越来越多研究人员的青睐，目前，花青素在视红素再合成[32]、抗炎症、提高免疫力[33]、治疗心脑血管疾病[34]、延缓和改善人体衰老[35]和抗癌[36]等方面的多种生理活性功能已得到普遍认可。

关于蓝莓花青素的提取工艺正在不断地得到完善，在传统的有机溶剂萃取

[37]

，优化萃取时间、萃取温度、萃取液配比等的基础上[38]，辅以超声振荡[39]、α-关于花青素相关产品较多的是紫甘薯中的花青素[41]，紫甘薯的特点是原料产

淀粉酶[40]等方法，在很大程度上提高了花青素提取率。

量大、价格便宜且花青素含量丰富。研究主要集中在软化血管、治疗糖尿病、癌症等生理功能上[42]。

关于花青素生理功能的研究主要集中在两方面，一是体外花青素抗氧化性和抑制肿瘤增殖等方面的试验，另一方面是建立动物（主要是小鼠）模型，通过对患病小鼠直接喂养花青素的形式获得花青素功能的实验依据。花青素对大肠杆菌的生长有明显的抑制作用[43]；葡萄籽原花青素在体外有明显抑制血小板聚集[44]的作用；紫甘薯花青素对小鼠急性乙醇性肝损伤具有良好的预防和保护作用[45]；葡萄籽原花青素对肾血管性高血压大鼠的血管有很好的重塑作用[46]；花青素对巴豆油诱发的小鼠肝线立体脂质过氧化[47]具有明显的改善效果。

目前关于花青素的研究也已经深入到基因水平，将花青素基因转入番茄[48]由于花青素具有非常强的抗氧化能力，使得花青素在提取和存储过程中极不稳定，很容易受到环境的破坏。因而近些年来针对加强花青素稳定性方面的研究也日益增多。一些研究成果表明，通过降低花青素存在的体系的酸度、减少食品中添加剂的用量[50]、使花青素与金属离子如铁、铝、钼等螫合[51]或是增加体系的

第一章文献综述

含糖量、避免光照[52]等方法，都可以在很大程度上提高花青素的稳定性，减少损失率。

1.4多酚类物质研究进展 1.4.1多酚类物质概述

植物多酚又称为植物单宁，是一类多元酚天然化合物。广泛分布于植物的各个组织和器官中[53]，在植物纤维管中的含量最高，含量最高可接近20%，仅次于纤维素和木质素。与花青素相同，植物多酚同样是植物的次级代谢产物[]，在植物体内起着重要的生理作用。

多酚类物质最早发现于植物源食品中，在一些常见植物源食品中，如水果、蔬菜、茶和红酒等，都有很高的含量。而与其它食物相比，可可豆中多酚类物质的含量特别高。多酚也是巧克力具有特殊香气成分的原因之一。

多酚类物质虽然广泛存在于植物源食品中，但是它在不同食品中的含量和结构有很大差异。而且，植物中多酚的含量会受到多种因素的影响，如水果和蔬菜的成熟程度、存储条件和食品加工过程的温度等，因此，补充植物源多酚类物质时，在选择食品过程中应从多个角度考虑。

近些年来，关于氧自由基的研究越来越多，它是人体的一种新陈代谢产物，能够伤害正常细胞，造成人体健康细胞的死亡，这个过程称为氧化损伤。氧化损伤可能导致多种慢性病，如动脉粥样硬化、糖尿病、关节炎、青光眼以及帕金森症等等。多酚类物质是人类可以从食物中摄取的很好的天然抗氧化剂，能够有效的清除人体内的氧自由基，可以对氧自由基引起的慢性病起到一定的缓解的作用。

目前，植物多酚类物质的提取方法大部采用乙醇[55]萃取的方式，来获得多酚类物质的粗提物，在得到粗提物之后，可以通过液相色谱法[56]、超临界二氧化碳萃取法[57]、大孔吸附树脂[58]等方法对多酚类物质进行分离和纯化。

目前研究较多的主要有葡萄和茶叶等。研究证实，葡萄酒中的多酚类物质可以很好地预防和改善动脉硬化[59]；绿茶中多酚类物质能够减轻缺血性脑损伤，能够改善衰老模型大鼠的学习和记忆[60]；薄荷精油中的多酚类物质对于多种对人体有害的细菌均有抑制作用[61]，原因在于其具有较强的DPPH自由基清除能力。

多酚类物质除了具有较强的抗氧化作用外，以色列的科学家还发现多酚类物质可以有效的抑制高热量食物在人体内产生的代谢物对人体的不利影响；黑米中多酚类物质能有效降低实验小鼠的血脂水平[62]；食用多酚物质含量较高的紫玉米

第一章文献综述

[63]

和樱桃[]可以明显的减轻实验小鼠的肥胖症状[65]。除此以外，还有很多研究近年来，国外学者开始广泛关注植物中结合型多酚类物质和游离型多酚类物

结果都显示，多酚类物质对防治脂肪累积具有潜在的功效。

质的研究[66]。研究显示：在蔬菜、谷类和豆类以及一些水果中都含有大量的结合型多酚类物质，而且结合型多酚类物质的含量远远多于游离型多酚类物质。也有研究表明在杨梅、杏和香蕉中结合型多酚类物质的含量比游离型多酚类物质多4倍以上[67]，也有一些研究采用碱水解的方法分析了小麦中结合型和游离型多酚类物质的含量，并对它们的抗氧化能力进行了比较，最终得到与之前相同的结论，结合型多酚类物质的含量是远远高于游离型多酚类物质[68]，而在抗氧化方面的贡献也是结合型多酚类物质较大[69]。

1.5研究背景、目的和意义 1.5.1 研究背景及意义

目前肿瘤成为威胁人们生命健康的重要疾病，肿瘤分良性肿瘤和恶性肿瘤两种，良性肿瘤在病发时只有对人体器官组织挤压和阻塞作用，通过手术治疗后，部分能够彻底治愈，具有不扩散、治愈后不复发的特点。但是恶性肿瘤因为其快速增殖能力和随血液扩散的特点，病发后，病情大都非常顽固，通常很难治愈。

恶性肿瘤中，乳腺癌是世界范围内女性排名第一的常见恶性肿瘤，在所有女性检出的癌症中，乳腺癌占30%，高出排在第二位的常见呼吸道癌症两倍之多。在我国北京、天津和广州等大城市的统计结果中显示，乳腺癌同样是我国女性最常见且致死率最高的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。专家呼吁，应进一步加强对这种恶性肿瘤的预防和控制。

然而，目前常用的放疗和化疗方法在对癌细胞造成伤害的同时，也对人体的健康细胞造成了难以恢复的损伤。因此在植物源体内探索发现具有抗癌性的物质也成为当前肿瘤治疗的研究热点[70]，在天然生物中提取出来的物质均有营养保健和无毒无害的特点，若在这方面有所突破，将掀开人类抗击肿瘤的新战役。

目前国内外对蓝莓的研究多集中在生物活性功能成分的分离提纯以及含量测定、抗氧化功能等方面，并且已经证实了蓝莓具有非常强的抗氧化性和清除氧自由基的能力，对于改善人的记忆能力、软化心脑血管、提高免疫能力也有明显的作用[71]。

对于蓝莓功能的研究限定在活性物质抗氧化性的测定、提取物抑制体外癌细胞增殖和蓝莓粗提物直接喂养小鼠改善其记忆能力等实验，而对于具有抗肿瘤活

第一章文献综述

性的蓝莓成分经过消化系统消化吸收后是否仍然有效，以及起到抗肿瘤作用的主要成分的阐述并不清晰。对于蓝莓抗肿瘤活性的研究结论上一直存在争议，争议主要集中在抗肿瘤作用的主要功能成分是花青素还是多酚类物质；蓝莓抑制肿瘤的作用机理以及蓝莓具有抑制肿瘤的功能成分经过消化系统之后是否依然具有抗肿瘤性质这三方面。因此，对于蓝莓花青素和多酚类化合物在抑制肿瘤方面的功能还缺乏比较全面的分析和评价。

本课题以蓝丰鲜果为研究材料，采用酸化甲醇浸提法提取花青素粗提物以及乙醇浸提法提取多酚类化合物的粗提物，通过AB-孔吸附树脂法获得蓝莓花青素及多酚类化合物的纯化品。

在得到四种物质之后，分别进行体外抗氧化实验、体外MTT方法检测MDA-MB-231肿瘤细胞抑制实验、乳腺癌模型小鼠实验来综合分析蓝莓花青素及多酚类物质的抗氧化能力与其在体内的生物活性的关系；分析蓝莓提取物中对肿瘤抑制起关键或主要作用的成分；分析蓝莓提取物中的功能成分在经过小鼠消化系统之后对肿瘤细胞的抑制效果是否有变化。最终通过液质联用仪分析蓝莓花青素及多酚类化合物中所含物质，分析出物质结构与对肿瘤抑制效果之间的关系，为天然物质治疗肿瘤提供理论上的支持。

1.5.2 研究内容

（1）本论文选用蓝莓（蓝丰）鲜果为实验材料，采用甲醇浸提法提取蓝莓花青素，同时采用乙醇浸提法提取蓝莓多酚类化合物粗提物。

（2）蓝莓花青素及多酚类化合物粗提取物的纯化：利用AB-孔吸附树脂法纯化蓝莓花青素及多酚类化合物，除去两种粗提物中存在的少量蛋白质及糖类，得到这两种物质的纯化品。

（3）蓝莓提取物体外抗氧化能力研究：利用DPPH法、ABTS法、FRAP法测定蓝莓花青素粗提物，蓝莓多酚类化合物粗提物、蓝莓花青素纯化品以及蓝莓多酚类化合物纯化品这四种物质的抗氧化性，并进行抗氧化能力的比较。

（4）蓝莓花青素、多酚类化合物粗提物及纯化品体外抑制肿瘤细胞增殖实验：采用MTT法，通过分析检测四种提取物对肿瘤细胞MDA-MB-231增殖的抑制率，比较分析蓝莓花青素和多酚抑制肿瘤增殖的能力强弱，综合分析提取物抑制肿瘤增殖能力与其体外抗氧化能力之间的关系。

（5）通过建立乳腺癌小鼠模型对蓝莓提取物体内抗癌能力的研究：利用鼠源乳腺癌细胞CD-1乳腺注射的方法建立乳腺癌小鼠模型，分高中低剂量对建模小鼠灌胃蓝莓提取物，通过分析免疫器官指数，淋巴细胞转化能力，巨噬细胞吞噬能力，肝脏组织及肺部组织的SOD活力及MDA含量等指标，综合比较几种提

第一章文献综述

取物的抗肿瘤能力，并分析蓝莓提取物在经过小鼠消化系统之后对抑制肿瘤能力的影响。通过这两种功能成分单一和组合的方式作用于致病小鼠来确定这两种重要的活性物质的生物活性强弱以及之间的互作效应（增强或抑制）。

（6）通过液-质联用技术对蓝莓花青素和多酚类化合物进行成分和结构的分析：

在明确蓝莓提取物的生理功能的基础之上，通过液-质联用一级质谱对蓝莓花青素和多酚类物质进行成分分析和结构判断，得出提取物中主要成分和相应的结构，建立分子结构与生理功能之间的关系，为蓝莓功能性产品开发奠定理论依据。

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

为了系统研究蓝莓花青素和多酚类物质的抗氧化活性和抗乳腺癌活性，分析抗氧化性与其抑制肿瘤的生理功能之间的联系，首先需要获得两种物质的粗提物和纯化物。本文意在研究蓝莓中两种主要的抗氧化活性物质花青素和多酚类化合物的抗氧化活性的强弱关系。因此，需要将蓝莓中花青素和多酚类化合物分别进行提取，并对其进行纯化，得到花青素和多酚类化合物的纯化物，进而比较两种化合物的抗氧化性，为探明抗氧化性和其抗癌性的生理功能之间的联系奠定基础。

2.1实验材料 2.1.1实验仪器

表2-1实验仪器

Table 2-1 Experimental Apparatus

仪器名称精密电子天平冷冻干燥机旋转蒸发仪数显恒温水浴锅

层析柱

紫外可见分光光度计

紫外检测仪自动部分收集器

横流泵电脑采集器冷冻干燥机

型号 BS-124S FD-1C-50 RE52CS HH 1.6×50cm UV-1800PC HD-3 BSZ-100 HL-2 HD-A FD-1C-50

公司

北京赛马里斯仪器有限公司北京博医康实验仪器公司上海亚荣生化仪器厂

金城国际上海层析柱厂上海美谱达仪器有限公司上海沪西分析仪器有限公司上海沪西分析仪器有限公司上海沪西分析仪器有限公司上海沪西分析仪器有限公司北京博医实验仪器有限公司

2.1.2 主要试剂

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

表2-2实验药品和试剂

Table 2-2 Experimental Chemicals & Reagents

试剂名称公司 AB-孔吸附树脂南开大学树脂公司

ABTS Sigma Chemical Co. DPPH Sigma Chemical Co. 铁天津市江天化工技术有限公司三氯化铁天津市江天化工技术有限公司

浓盐酸、甲醇、正己烷、乙酸乙酯天津市江天化工技术有限公司乙醇、石油醚（60-90）、乙酸乙酯天津市江天化工技术有限公司

2.2 试验方法

选取大连产的蓝丰作为试验材料。商业成熟时采收，成熟度均匀一致。在基地采摘，避光储存蓝莓待其释放生物热后，装箱空运至实验室。立即用液氮对蓝莓鲜果进行速冻处理，使蓝莓整果由内到外完全冻结，转到-80℃冰箱内存放待用。

取速冻蓝莓鲜果，在尚未解冻的情况下快速将蓝莓果捣碎，以减少样品的氧化，捣碎后，放入冷冻干燥盘中，在冰箱中冷冻，使其符合冷冻干燥操作的要求，冷冻干燥24小时，样品即可干燥完毕后成粉末状，在-30℃冰箱中冷冻保存，后续实验使用。

2.2.1蓝莓花青素、多酚类化合物粗提物的制备

2.2.1.1 蓝莓花青素粗提物的制备

取蓝莓干粉150g放入1000mL烧杯中，加入750ml酸化甲醇（甲醇：浓盐酸=99.5：0.5），用搅拌器搅拌体系，使样品与萃取剂充分接触，萃取时间为4h，萃取结束后，静置、过滤，取萃取液，残渣再进行两次萃取，使蓝莓花青素充分溶解。合并萃取液。

将萃取液在40℃下进行旋转蒸发干燥，干燥至粘稠状时停止。

将粘稠状物质先用正己烷进行液液分层萃取去除脂类物质（粘稠状物质：正己烷=1：5），去除上清液并回收正己烷，对下层萃取物重复萃取3次。

取上步操作中萃取好的下层萃取物继续用乙酸乙酯萃取，（萃取物：乙酸乙酯=1：5），取上清夜，重复萃取操作3次，合并上清液。40℃下旋转蒸发上清液，

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

至不能再蒸发出乙酸乙酯时停止，取出粉饼状物质，冻结后冷冻干燥24h，干燥结束即得到蓝莓花青素粗提物。 2.2.1.2 蓝莓多酚类化合物粗提物的制备

取蓝莓干粉150g放入1000mL烧杯中，加入750mL无水乙醇，用搅拌器搅拌体系，使样品与萃取剂充分接触，萃取时间为4h，萃取结束后，静置、过滤，取萃取液，残渣再进行两次萃取，使蓝莓多酚类物质充分溶解。合并萃取液。

将萃取液在40℃下进行旋转蒸发干燥，干燥至粘稠状时停止。

将粘稠状物质先用石油醚进行液液分层萃取去除脂类物质（粘稠状物质：石油醚=1：5），去除上清液并回收石油醚，对下层萃取物重复萃取3次。

取上步操作中萃取好的下层萃取物继续用乙酸乙酯萃取，（萃取物：乙酸乙酯=1：5），取上清夜，重复萃取操作3次，合并上清液。40℃下旋转蒸发上清液，至不能再蒸发出乙酸乙酯时停止，取出粉饼状物质，冻结后冷冻干燥24h，干燥结束即得到蓝莓多酚类物质粗提物。

2.2.2蓝莓花青素及多酚类化合物纯化品的制备

2.2.2.1 AB-孔吸附树脂的预处理及树脂床的准备

AB-孔吸附树脂处理方法如下：

1、用体积约为吸附树脂体积两倍的95%乙醇浸泡18-20小时，然后排尽乙醇，用大量的清水漂洗，洗至排出水不再带有黄色为止。

2、用浓度为2%-4%的NaOH溶液浸泡，液体体积约为树脂体积两倍，浸泡2-4小时，然后排尽碱液，用大量的清水漂洗，用pH试纸检测漂洗液，至中性为止。

3、用浓度为5%的HCI溶液浸泡，液体体积约为树脂体积两倍，浸泡4-8小时，排尽酸液，用大量清水漂洗，用pH试纸检测漂洗液，至中性为止。

4、将处理好的大孔吸附树脂与水混合，边搅拌边注入层析柱中，静置成床后，从层析柱下方排除多余水分，整个树脂床占层析柱2/3柱高时停止。

5、分别用两倍柱体积的蒸馏水、2%NaOH溶液、5% HCI溶液和95%乙醇溶液以6 mL/min的流速过柱，对树脂床进行处理，静置待用。 2.2.2.2 蓝莓花青素提取物纯化品的制备

采用AB-孔吸附树脂对蓝莓花青素粗提物进行纯化。将100mg蓝莓粗提物溶于50mL酸化甲醇中，进样前用45μm有机针膜过滤，以增长树脂床的使用寿命。用恒流泵将蓝莓粗提物溶液泵入预先处理好并填充好的大孔吸附树脂中，

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

待提取物溶液充满树脂床时停泵10min，使蓝莓花青素能够充分吸附在树脂上，接着用酸化蒸馏水进行冲洗，此过程可以除掉蓝莓粗提物中的蛋白质和糖类物质，酸化蒸馏水冲洗大孔吸附树脂30min之后，用酸化甲醇解吸附，当采集器在280nm处出现较高示数时开始收集洗脱液。重复此过程，合并洗脱液。洗脱液在40℃下旋转蒸发，蒸发到不能再蒸发出甲醇为止，倒出溶液，-30℃下冻结溶液，冷冻干燥24 h，得到蓝莓花青素纯化品。 2.2.2.2 蓝莓多酚类化合物提取物纯化品的制备

蓝莓多酚类化合物提取物纯化品的制备过程基本花青素纯化品的制备一致，只是所用洗脱剂不同，多酚类化合物的洗脱剂为乙醇，收集合并洗脱液后，在30℃旋转蒸发，蒸发到没有乙醇为止，倒出溶液，-30℃下冻结溶液，冷冻干燥24 h，得到蓝莓多酚类物质纯化品。

2.2.3蓝莓花青素、多酚类物质抗氧化活性测定

机体内保持自由基含量的动态平衡对于机体加强抗氧化防御，减少自由基对正常细胞的损伤以及预防癌症、心脑血管疾病和衰老非常重要。

近些年来，欧美一些国家日益盛行起来通过进食富含抗氧化剂的蔬菜或水果来减少机体受氧自由基的损伤，因此对具有高抗氧化剂含量的食品源的开发和研究逐渐成为一个热点。

在富含抗氧化剂食品的开发过程中，食品素材在体内和体外的抗氧化能力自然成为衡量一个食品抗氧化能力最好的指标，但是体内实验受到饲养条件，测定周期长，一般较少采用。因此，体外实验法是目前最为常用的衡量标准。

常用的体外抗氧化方法有总抗氧化能力测定、DPPH法、ABTS法和羟基自由基清除法。每种检测方法有各自的检测意义，而且不同的检测方法之间数据相关性不大，因此在实验过程中要根据自己的实验目的有选择性的进行体外抗氧化实验。

总抗氧化能力测定的是物质的总还原能力，是对物质中所含天然抗氧化剂的总量的评价。DPPH和ABTS法是应用的比较成熟的测定物质自由基清除能力的方法，在近些年的研究中得到非常多的应用，使用方法也在逐渐的改进中变得更加方便、快捷，测量结果更加精确。

本实验中采用了总抗氧化能力测定、DPPH法和ABTS法对蓝莓花青素和多酚类化合物的粗提物和纯化物进行了抗氧化性的比较。

配制蓝莓花青素粗提物、蓝莓多酚类化合物粗提物、蓝莓花青素纯化物和蓝莓多酚类化合物纯化品的溶液，分别都得到浓度为1000μg/mL、500μg/mL、

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

250μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL八个浓度梯度的溶液。配制好后冷藏待用。

2.2.2.1蓝莓花青素、多酚类物质总抗氧化能力测定

采用总抗氧化能力测定[72]，取一定量的样品溶液，加入2.5mLpH6.6的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）和2.5mL1%的铁溶液，混匀，在50℃条件下保温20min后加入2.5mL1%的三氯乙酸，混合后以3000r/min离心10min。取上清液2.5mL蒸馏水和0.5mL0.1%的三氯化铁，然后在700nm波长处比色。 2.2.2.2蓝莓花青素、多酚类物质清除ABTS自由基能力

ABTS自由基被活性氧氧化后是一种蓝绿色的阳离子自由基，能以稳定的状态存在。与其他几种体外抗氧化能力测定法相比，ABTS法具有简便、快速、与抗氧化剂的生物活性相关性强的优点，因而在生物样品、果蔬类和一些纯物质的抗氧化能力测定方面应用的十分广泛。当在ABTS体系内加入含有抗氧化成分之后，就会与ABTS自由基发生反应而使体系的蓝绿色变迁，在734nm处的吸光度就会产生相应的变化，因此可以通过吸光度的变化来衡量被测物质的的抗氧化性。

实验方法参考Oyaizu, M.[73]。

2.2.2.3 蓝莓花青素、多酚类物质清除DPPH自由基作用

DPPH自由基清除率体外实验通常被用来衡量被测物质对机体自由基的清除能力。DPPH自由基之所以被普遍用来衡量生物体的抗氧化活性，其具有价格便宜、实验操作快速简单和活体无法再生的特点。

DPPH自由基清除法测定抗氧化活性的方法参照Lohachoompol[63]并稍作修改。

2.3 结果与分析

2.3.1 蓝莓花青素、多酚类物质的纯化

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

图2-1 AB-孔吸附树脂纯化蓝莓花青素粗提物

Fig. 2-1 Purification of blueberry anthocyanins compounds crude extract 如图2-1所示，第一个峰为杂质和漏出液共同形成的峰，第二个峰为蓝莓花青素的纯物质峰。

图2-2 AB-孔吸附树脂纯化蓝莓多酚类化合物粗提物 Fig. 2-2 Purification of blueberry polyphenolic compounds crude extract 如图2-2所示，显示的是两次对蓝莓多酚进行纯化的吸收光谱，其中，第一个和第三个峰为杂质和漏出液共同形成的峰，第二个和第四个峰为蓝莓多酚类物质的纯物质峰。

2.3.1蓝莓花青素、多酚类物质还原能力

一般情况下，被测物质中抗氧化物质的含量与其测定出的总还原能力呈正相关，根据总还原能力测定法的原理，被测体系在700nm处的吸光值越大说明被测体系的还原能力越强。

如图2-3可知，四种物质中，每一种物质的抗氧化能力随该物质的浓度的增加而增加，呈一定的量效关系。不同物质之间抗氧化能力存在着比较明显的差异，通过比较可以看出抗氧化能力的大小关系为：蓝莓花青素提取物的纯化品﹥蓝莓

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

多酚类化合物纯化品﹥蓝莓花青素粗提物﹥蓝莓多酚类化合物粗提物。

图2-3四种提取物还原能力的比较

Fig 2-3. Comparison of the deoxidization activity of the four extracts

2.3.2蓝莓花青素、多酚类物质清除ABTS自由基能力

实验结果如图2-4所示，将蓝莓四种提取物的抗氧化能力转换为Trolox当量之后，可以看出四种提取物的ABTS自由基清除能力的大小依次为：花青素提取物的纯化品、多酚类化合物纯化品、花青素粗提物和多酚类化合物粗提物。两种纯化物的ABTS自由基清除力显著高于两种粗提物（P<0.05），花青素ABTS自由基清除能力强于多酚类物质，花青素纯化物ABTS自由基清除能力是多酚粗提物的3倍多。

图2-4 四种提取物对ABTS自由基清除能力比较

Fig. 2-4 Activity of removing ABTS radicals in four extracts

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

2.3.3 蓝莓花青素、多酚类物质的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基能够在有机试剂中稳定存在、呈现紫色并在517nm处有一个特征吸收峰，该方法应用起来非常简便、快捷并且重现性好，在天然有机化合物，例如植物提取物的抗氧化活性的考察上被广泛使用。

DPPH自由基的作用机理为：当DPPH中加入的被测物中含有抗氧化剂，则抗氧化剂就会与孤对电子配对，使其在特征吸收波长处的吸光度变小。因此可以用吸光度的变化来衡量被测物中抗氧化剂的含量。

如图2-5所示，蓝莓四种提取物都具有较强的抗氧化性，当四种提取物的浓度在10-50μg/mL之间变化时，抗氧化能力差距显著（P<0.05），两种粗提物存在剂量效应，在达到一定浓度时，DPPH自由基的清除率都可以达到90%，当四种物质的浓度都为125μg/mL时，之间的抗氧化水平差距不大，可能是DPPH自由基消耗殆尽的原因。可以明显比较出抗氧化能力大小关系为：蓝莓花青素提取物的纯化品﹥蓝莓多酚类化合物纯化品﹥蓝莓花青素粗提物﹥蓝莓多酚类化合物粗提物。

图2-5 四种提取物对DPPH自由基清除能力的比较

Fig 2-5. The DPPH radical-scavenging activity of four extracts

2.4 小结

为了确定蓝莓功能成分中起主要抗氧化作用的是花青素还是多酚类化合物以及抗氧化性与蓝莓抗肿瘤活性之间的关系，本部分实验用了不同的提取方法分离得到花青素和多酚类化合物，并同时对这两种物质进行了纯化。同时通过三种方法测定并比较这几种蓝莓提取物的抗氧化性，得到的结论一致，可以明显比较出抗氧化能力大小关系为：蓝莓花青素提取物的纯化品﹥蓝莓多酚类化合物纯化

第二章蓝莓花青素、多酚类物质的纯化及抗氧化活性测定

品﹥蓝莓花青素粗提物﹥蓝莓多酚类化合物粗提物。

通过比较几种提取物的抗氧化能力的差别，可以分析出以下几点： 1、蓝莓花青素粗提物和多酚类化合物粗提物经过AB-孔吸附树脂纯化后，所得到的纯化物抗氧化能力明显提高。

2、蓝莓中所含花青素的抗氧化能力要强于多酚类化合物，与一些文章的研究成果不一致，可能是因为不同品种蓝莓果实中这两种活性物质的含量以及所含成分的不同造成的。

这部分实验确定了各组成部分的抗氧化性的强弱关系，同时为后续抗氧化能力与抗肿瘤活性之间关系的研究奠定了基础。

第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用研究

第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用

研究

本章考察了四种蓝莓提取物体外对肿瘤细胞增殖的抑制效果，目的在于验证一些学者对蓝莓体外抑制肿瘤增殖能力的结论的正确性并探究四种提取物抑制肿瘤的能力与其抗氧化能力之间的关系。这部分实验将为下一章进行的小鼠乳腺癌模型动物试验提供不同实验组的分组依据，并为验证蓝莓功能性提取物在经过小鼠消化道消化作用后是否对其抗氧化性具有影响，以及每种提取物受到的影响的程度提供前提依据。

3.1实验材料 3.1.1 药物和试剂

表3-1实验药品和试剂

Table 3-1 Experimental Chemicals & Reagents

试剂名称

浓盐酸、甲醇、正己烷、乙酸乙酯

RPMI-10培养基

胰蛋白酶 MTT(四甲基噻唑蓝)

胎牛血清 DMSO（二甲基亚砜）

96孔板

公司

天津市江天化工技术有限公司

Gibco Sigma Amresco

MDgenics incorporation 天津市江天化工技术有限公司 Galaxy，Stephen Clark Fabrieations Ltd

3.1.2 实验器材

表3-2实验仪器

Table 3-2 Experimental Apparatus

仪器名称精密电子天平高速冷冻离心机

型号 BS-124S CR21G

公司

北京赛马里斯仪器有限公司日立公司

第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用研究

续表3-2

普通光学显微镜

酶标仪 CO2细胞培养箱

立式压力蒸汽灭菌器

超净工作台细胞计数板 WH-1微型涡旋混合仪

针头滤器

一次性使用无菌注射器

低速离心机

BH-2型 MK3 72862-415

YXQ-LS-50SII SW-CJ-1FD YBL10-71103

WH-1 0.2μm 5mL TDL-5

OLYMPUS

Thermo热电仪器有限公司

Forma Scientific

上海实业有限公司医疗设备厂

苏州净化设备有限公司

中西集团

上海沪西分析仪器厂有限公司

Whatman

浙江欧健医用器材有限公司

上海安亭科学仪器厂

3.2 试验方法 3.2.1细胞培养

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231由天津肿瘤医院生物化学与分子生物学实验室惠赠。

复苏冻存的MDA-MB-231细胞，离心去除冻存液，加入含10%血清的RPMI-10 培养液，于37℃饱和湿度5%CO2孵箱中静置培养细胞，生长到80%后，加入2.5mL 胰蛋白酶消化，待细胞变圆，间隙增大时，弃消化液，加入10mL培养液终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液，按1/4比例传代，每3至4天传代1次。

3.2.2细胞计数

（1）将血球计数板及盖玻片擦拭干净，并将盖玻片盖在血球计数板上。（2）将细胞悬液吸出少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

（3）静置3分钟。

（4）镜下观察，计算计数板四个大格的细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/mL＝4 大格细胞总数/ 4×104

第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用研究

3.2.3 MTT实验法

MTT，是一种黄色染料，又名噻唑蓝。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

具体实验步骤参考朱文菁等[73]：略有改动。其中试验组则分别以含50、100、200、250、500、1000、1500、2000 μg/mL蓝莓花青素粗提物、花青素纯化物和多酚物质粗提物、多酚物质纯化物的完全培养液(0.1％DMSO)培养

3.3 结果与讨论

3.3.1四种提取物作用下MDA-MB-231细胞增殖率

图 3-1 MDA-MB 231细胞的增殖率

Fig. 3-1 Percentage of proliferation of MDA-MB-231 cells

由图3-1所示，可以明显的比较出四种物质的抑制肿瘤能力的强弱顺序：花青素粗提物﹥多酚物质粗提物﹥多酚物质纯化物﹥花青素纯化物。结合体外抗氧化实验蓝莓花青素提取物的纯化物﹥蓝莓多酚类化合物纯化物﹥蓝莓花青素粗提物﹥蓝莓多酚类化合物粗提物的结果，可以分析出，蓝莓花青素和多酚类化合物的体外抑制肿瘤细胞增殖能力与其抗氧化能力并非呈正相关性。相反，蓝莓花青素粗提物和多酚类化合物粗提物经过大孔吸附树脂纯化后虽然抗氧化性得到明显的提高但是体外抑制肿瘤细胞增殖的能力却下降。说明，两种生物活性物质在纯化过程除去的蛋白质和多糖类物质在其发挥体外抑制肿瘤细胞增殖能力时也起到很重要的作用。

第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用研究

3.3.2花青素粗提物与纯化物作用下MDA-MB-231细胞增殖率

图 3-2 花青素粗提物和纯化物组中MDA-MB-231细胞增殖率 Fig 3-2. Percentage of proliferation of anthocyanin crude extract and the

purified product of MDA-MB-231 cells

由图3-2可知，在实验设置的浓度下，花青素粗提物的肿瘤抑制率始终高于花青素纯化样品的肿瘤抑制率。花青素粗提物与花青素纯化样品抑瘤率随浓度变化的曲线趋势基本相似，可以推断出花青素的抑瘤作用源于花青素本身的特性。由抗氧化实验表明，花青素经过柱层析纯化后，抗氧化性得到提高。花青素纯化样品的抗氧化性强于花青素粗提物的抗氧化性，抑制肿瘤的能力却低于花青素粗提物，说明花青素的抑瘤作用虽然在一定程度上源于其特殊的结构，同时还存在其他起到辅助增强作用因素的影响或者存在其他本实验未研究到的具有抑制肿瘤细胞增殖作用的物质。

3.3.3多酚类物质粗提物与纯化物作用下MDA-MB-231细胞增殖率

第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用研究

图 3-3 多酚物质粗提物和纯化品组MDA-MB-231细胞增殖率 Fig 3-3. Percentage of proliferation of polyphenols crude extract and the

purified product of MDA-MB-231 cells 由图3-3可知，虽然蓝莓多酚类化合物纯化后样品抑制肿瘤增殖能力低于多酚粗提物，但两者能力之间的差别没有蓝莓花青素与其纯化物之间的差距那样大。因此可以推断：蓝莓多酚类化合物体外抑制肿瘤细胞增殖的功能相对，受其他物质的交互作用的影响较小，在这一点上与花青素的抑制肿瘤细胞增殖的作用方式不同。

3.3.4花青素与多酚类物质粗提物作用下MDA-MB-231细胞增殖率

图 3-4 花青素和多酚物质粗提物组MDA-MB-231细胞增殖率 Fig 3-4. Percentage of proliferation of anthocyanins and polyphenols crude

extracts of MDA-MB-231 cells

由图3-4可知，花青素粗提物、多酚物质粗提物两种物质的抑瘤率均在较低浓度（50μg/mL）即达到较高值，且在实验设定的浓度范围内两种提取物的肿瘤抑制率呈现相同的变化规律，并呈较为明显的量效关系。

第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用研究

3.3.5花青素与多酚类物质纯化物作用下MDA-MB-231细胞增殖率

图 3-5 多酚物质和花青素纯化品组MDA-MB-231细胞增殖率 Fig 3-5. Percentage of proliferation of polyphenols and anthocyanins purified

product of MDA-MB-231 cells 实验表明，在相同浓度下，多酚物质纯化物的抗氧化能力较之花青素纯化物较弱，但是本实验结果显示，多酚物质纯化物的抑癌率在本实验设置的各浓度下都高于花青素纯化物组。花青素纯化物、多酚物质纯化物的抗氧化性与各自的抑瘤效果不一致，再次说明，多酚物质抑瘤机制另有因素。可能的原因是：多酚单独存在抗氧化性较弱但具有较强抑瘤效果的官能团；花青素中含有的抗氧化性较强的官能团较多，但多数官能团抑制肿瘤的能力较弱。

以物质浓度为500μg/mL时为例，蓝莓花青素粗提物、花青素纯化样品、多酚物质粗提物和多酚物质纯化样品四种提取物的肿瘤抑制率均差异显著(P<0.05)。

3.4 小结

蓝莓中花青素和多酚类化合物的抑制肿瘤的特殊功能在近些年一直是寻找植物提取物治疗或辅助治疗癌症的研究的一个热点。

而引起广大学者如此重视蓝莓这种水果的原因主要是因为蓝莓果实内含有的大量的具有抗氧化功能的生物活性物质，除了常规的抗氧化物质如维生素A和维生素C等以外，蓝莓中大量的花青素和多酚类化合物自然成为关注的热点。

在本部分的实验中得到了以下结论：

第三章蓝莓花青素及多酚类物质体外抑制乳腺癌细胞增殖作用研究

1、在将蓝莓花青素和多酚类化合物用纯化后，相同浓度下蓝莓多酚类化合物在体外抑制肿瘤增殖的能力更强，因此，结合抗氧化分析的结果，在排除其他影响因子的情况下，蓝莓多酚类化合物中存在更强的抑制肿瘤增殖的结构，这些结构可能在抗氧化性上相比蓝莓花青素中化合物的结构稍弱，在一定程度上说明这两种活性物质在体外抑制肿瘤增殖的能力并不是与抗氧化性呈正相关的。

2、未经过AB-孔吸附树脂除去蛋白质和多糖类化合物的蓝莓花青素和多酚类化合物的粗提取物在相同浓度下，蓝莓花青素粗提物体外抑制肿瘤增殖能力要强于多酚类化合物，这与之前的抗氧化分析的结果一致；而两种物质的粗提物的体外抑制肿瘤增殖能力均强于抗氧化性很强的纯化物，这再次说明两种活性物质的抑制肿瘤增殖能力与抗氧化能力间存在相关性但是关联性不大。

3、总体上分析，蓝莓花青素粗提物在经过纯化后，其体外抑制肿瘤增殖能力下降的幅度明显大于多酚类化合物粗提物，说明两种活性物质在抑制肿瘤增殖上的作用机制存在一些不同：蓝莓花青素体外抑制肿瘤增殖能力在特定蛋白质和多糖类化合物存在的情况下会得到明显提高，他们之间可能存在协同效用。虽然这种协同效应也存在于多酚类化合物中，但这种协同效应对多酚类化合物的影响相对花青素来讲并不大，可以推断蓝莓多酚类化合物的体外抑制肿瘤增殖的能力来源于多酚本身的分子结构。

综上所述，蓝莓体外抑制肿瘤增殖能力是一个混合体系共同作用的结果，其中蓝莓花青素在与蓝莓中存在的蛋白质和多糖类化合物的共同作用下效果最好，蓝莓多酚类化合物在这种协同效应下，抑制肿瘤增殖能力也得到较大提高。对于蓝莓花青素和多酚类物质这两种物质来讲，他们的抑制肿瘤增殖的作用原理可能是不同的。而抗氧化能力的强弱并不能直接作为一种物质抑制肿瘤增殖能力的衡量标准。

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

本章是整个课题的核心部分，建立了乳腺癌小鼠模型，结合蓝莓花青素和多酚类化合物在体外抑制肿瘤增殖实验的结果安排了动物实验的分组模式，并以环磷酰胺这种常用的治疗癌症的药物作为治疗效果的阳性对照组，通过测定各组小鼠的身体指标、淋巴免疫系统和体内抗氧化环境等一系列的指标，来比较不同蓝莓提取物对乳腺癌小鼠模型肿瘤的治疗和对身体各项机能的改善效果。

4.1 实验材料 4.1.1 药品和试剂

表4-1实验药品和试剂

Table 4-1 Experimental Chemicals & Reagents

名称公司

RPMI-10培养基台盼蓝红细胞裂解液胎牛血清印度墨汁 DMSO MTT Con A

注射用环磷酰胺（Cy）

Gibco Sigma

碧云天生物技术研究所 MDgenics incorporation 北京化学试剂公司

天津市江天化工技术有限公司

Amresco Sigma

江苏恒瑞医药股份有限公司

4.1.2 实验器材

表4-2实验仪器

Table 4-2 Experimental Apparatus

型号生产厂家 MC2301067 哈尔滨刃具有限责任公司 WH - 1 上海沪西仪器厂有限公司 BH - 2型 OLYMPUS

浙江欧健医用器材有限公司

仪器名称

数显游标卡尺 WH-1微型涡旋混合仪普通光学显微镜一次性无菌注射器

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

续表4-2

精密酸度计

紫外可见分光光度计

微量注射器台式高速离心机立式蒸汽灭菌器

酶标仪 CO2细胞培养箱细胞计数板

电热恒温鼓风干燥箱

超净工作台磁力搅拌器电子分析天平

PHS - 3B UV1102 100 μL TGL - 16B YXQ – LS - 50SII

MK 3 72862 - 415 YBL10 - 71103 DH - 101 SW-CJ - 1FD 79HW - 1 BS - 124S

上海精密科学仪器有限公司上海天美科学仪器有限公司北京吉安得尔科技有限公司

上海安亭科学仪器厂上海实业医疗设备厂 Thermo热电仪器有限公司

Forma Scientific 中西集团

天津市中环实验电炉有限公司

苏州净化设备有限公司

江苏金坛市荣华仪器制造有限公司赛多利斯科学仪器(北京)有限公司

4.1.3实验用动物及癌细胞

实验用小鼠：Balb/c雌性小鼠购自北京华阜康公司，鼠龄四周，小鼠均体重12g，购买后在实验室内饲养两天以适应环境。

实验用癌细胞：活体培养的鼠源乳腺癌细胞CD-1，现用现取。

4.1.4实验用溶液

磷酸盐缓冲液；pH 7.4 Na2CO3溶液，浓度0.1%； 25%印度墨汁（现用现配）；浓度100 μg/mL的刀豆蛋白(Con A)液；含有10%灭菌胎牛血清的RPMI-10培养基；5mg/mL MTT溶液。

4.2 试验方法 4.2.1 试验组的设置

将Balb/c雌性小鼠随机分成18组，每组12只，依次命名为正常对照组（NC）、阴性对照组（TC）、阳性对照组（PC）、蓝莓花青素粗提取物高剂量组（BBAC-HD）、蓝莓花青素粗提取物中剂量组（BBAC-MD）、蓝莓花青素粗提取物低剂量组（BBAC-LD）、蓝莓花青素纯化品高剂量组（BBAP-HD）、蓝莓花青素纯化品中剂量组（BBAP-MD）、蓝莓花青素纯化品低剂量组（BBAP-LD）、蓝莓多酚类物质粗提取物高剂量组（BBPC-HD）、蓝莓多酚类物质粗提取物中剂量组（BBPC-MD）、

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

蓝莓多酚类物质粗提取物低剂量组（BBPC-LD）、蓝莓多酚类物质纯化品高剂量组（BBPP-HD）、蓝莓多酚类物质纯化品中剂量组（BBPP-MD）、蓝莓多酚类物质纯化品低剂量组（BBPP-LD）、蓝莓花青素与多酚类物质粗提物混合组高剂量组（BBCM-HD）、蓝莓花青素与多酚类物质粗提物混合组中剂量组（BBCM-MD）、蓝莓花青素与多酚类物质粗提物混合组低剂量组（BBCM-LD）。

4.2.2 建模方法

从携带鼠源乳腺癌细胞CD-1的小鼠体内无菌操作获取鼠源乳腺癌细胞CD-1瘤块，将瘤块放入组织研磨器中，同时加入灭菌的生理盐水，进行研磨，重复研磨后，取出瘤细胞悬浊液，用生理盐水将悬浊液稀释成细胞浓度为1×106个/mL。

除正常组外，其余各组小鼠均在右前足附近胸腺接种鼠源乳腺癌细胞CD-1悬液 0.2 mL。

表4-3动物实验分组设计方案

Table 4-3 The animal experiments grouping design

分组剂量 N C 0.2mL 生理盐水 P C 20mg/(kg bw·d) 环磷酰胺 + 0.2mL 生理盐水 T C 0.2mL 生理盐水 BBAC - HD 150mg/(kg·d) BBAC - HD + 0.2mL 生理盐水 BBAC - MD 100mg/(kg·d) BBAC - MD + 0.2mL 生理盐水 BBAC - LD 50mg/(kg·d) BBAC - LD + 0.2mL 生理盐水 BBAP - HD 150mg/(kg·d) BBAP - HD + 0.2mL 生理盐水 BBAP - MD 100mg/(kg·d) BBAP - MD + 0.2mL 生理盐水 BBAP - LD 50mg/(kg·d) BBAP - LD + 0.2mL 生理盐水 BBPC - HD 150mg/(kg·d) BBPC - HD + 0.2mL 生理盐水 BBPC - MD 100mg/(kg·d) BBPC - MD + 0.2mL 生理盐水 BBPC - LD 50mg/(kg·d) BBPC - LD + 0.2mL 生理盐水 BBPP - HD 150mg/(kg·d) BBPP - HD + 0.2mL 生理盐水 BBPP - MD 100mg/(kg·d) BBPP - MD + 0.2mL 生理盐水 BBPP - LD 50mg/(kg·d) BBPP - LD + 0.2mL 生理盐水 BBCM - HD 150mg/(kg·d) BBCM - HD + 0.2mL 生理盐水 BBCM - MD 100mg/(kg·d) BBCM - MD + 0.2mL 生理盐水 BBCM - LD 50mg/(kg·d) BBCM - LD + 0.2mL 生理盐水

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

4.2.3 肿瘤抑制实验

在建模后第14天开始，用游标卡尺每两天测量一次肿瘤的短径和长径，并按照下式计算肿瘤的体积：

肿瘤体积(mm3)=0.52×短径2×长径。

眼窝取血后处死小鼠，依次摘取胸腺、脾和肿瘤，用灭菌的生理盐水清洗后吸水纸吸干表面水分并准确称重，分别按照以下公式计算胸腺指数、脾指数和抑瘤率：

脾指数=脾质量(mg)/小鼠体重(g) 胸腺指数=胸腺质量(mg)/小鼠体重(g)

抑瘤率=(阴性对照组肿瘤质量平均值-剂量组肿瘤质量平均值)/阴性对照组肿瘤平均质量×100%

4.2.4迟发型超敏反应（DTH）

接种鼠源乳腺癌细胞CD-1后第17天，进行迟发型超敏反应实验。实验步骤参考实验步骤参考郑尧，何景华等[74]，略有改动。

4.2.5巨噬细胞吞噬实验（碳粒廓清实验）

实验步骤参考郑尧，何景华等[74]，略有改动。

4.2.6 MTT法淋巴细胞转化实验

实验步骤参考高捷等[75]，略有改动。

4.2.7肿瘤组织形态观察

剥离鼠源乳腺癌细胞CD-1小鼠肿瘤组织时，注意观察肿瘤外观形状，比较各组肿瘤大小，肿瘤生长出对周围组织器官有无压迫等破坏。剥离后观察肿瘤周围是否有出血现象，观察并比较肿瘤的颜色及是否包被有完整的假膜，同时用镊子轻轻按压肿瘤，感受各实验组肿瘤硬度差别。

4.2.8肝脏及肺部组织中SOD、MDA含量的测定

肝脏及肺部组织匀浆制备：称取肝脏及肺部组织，加入9倍质量的生理盐水，用组织研磨器将肝脏及肺部组织充分研磨，制备成组织匀浆备用，以上操作均在低温条件下进行，组织研磨应在冰上完成。

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

实验步骤参考南京建成SOD、MDA试剂盒。

4.2.9血清中NO含量的测定

血清制备：在做MTT法淋巴细胞转化实验时，摘取小鼠眼球取血后，处死小鼠，将所取血液放入装有2 mL Na2CO3溶液的一次性塑料试管中，摇匀，离心取血清，-20℃储存待用。

一氧化氮（NO）的测定采用还原酶法，试剂盒购自南京建成生物试剂研究所。其实验原理为：NO化学性质活泼，在机体内很快转为NO2- 有进一步转化为NO3-，本法利用还原酶特异性将NO3- 还原为NO2- ，通过显色深浅测定其浓度的高低。

4.3结果与讨论 4.3.1小鼠外观表现观察

在整个实验过程中保持对小鼠生活状态进行观察，观察内容主要包括：小鼠行动速度、精神状态、饮食状态、毛发色泽和杂乱程度及体质状态。正常组小鼠行动快速敏捷，有攀爬鼠笼的动作，单一小鼠精神状态良好，无扎堆现象，饮食状态良好，整组的饲料和水的用量较大，而且小鼠毛色健康有光泽，柔顺不杂乱，在抓取小鼠时，小鼠挣脱力量较大。

相比之下，阴性对照组小鼠在肿瘤长到一定程度时出现了行动迟缓、反映迟钝并且无攀爬鼠笼的动作，单一小鼠精神状态较差，常出现扎堆，发抖现象。进食和饮水量逐渐降低，小鼠毛发逐渐干枯进而失去光泽，并出现脱毛和毛发杂乱的现象，在抓取小鼠时，小鼠挣脱欲望不强，力量相对较弱。

同时阳性药物组小鼠由于受到治疗药物的影响，身体机能受到很大的影响，小鼠几乎无活动现象，单一的分散在鼠笼中，身体发抖，进食和饮水量非常少，小鼠毛发干枯和脱落现象非常明显，在抓取小鼠时，小鼠身体软弱并且几乎无反抗能力。

蓝莓花青素和多酚类化合物实验组中的小鼠，由于受到体内肿瘤不断生长的影响，各组别和各剂量组下的小鼠均出现不同程度上的和阴性对照组中小鼠相同的状况，但整体上实验组小鼠精神状态和进食量优于阴性对照组，毛发光泽减弱，但未出现杂乱和脱毛的症状，在抓取小鼠时，小鼠挣脱欲望较强，力量也明显大于阴性对照组。

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

N C BBAC - HD BBAP - HD BBPC - HD BBPP - HD BBCM - HD BBCM - MD 图4-1 小鼠身体及肿瘤状态

Fig 4-1. Status of the mouse physically and tumor growth

BBPP - MD BBCM - LD BBPC - MD BBPP - LD BBAP - MD BBPC - LD BBAC - MD BBAP - LD T C BBAC - LD P C 31

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

4.3.2实验过程中小鼠肿瘤生长变化

在整个实验过程中，对小鼠肿瘤进行了三次测量，实验结果如图4-2所示。可以明显的看出，阴性组小鼠的肿瘤一直以较快的速率增长，阳性药物组小鼠肿瘤增长速率最慢。其他实验组小鼠增长速率介于以上两组之间，其中，两种活性物质粗提物的混合物对小鼠肿瘤的抑制效果最接近阳性药物组，效果最好。另外几组无显著性差异，从最终的效果上来看，几种提取物的抑制肿瘤的能力强弱关系为：花青素粗提物﹥多酚类化合物粗提取物﹥花青素纯化品﹥多酚类化合物纯化物。与阴性对照组小鼠肿瘤体积相比，阳性对照组、混合组、花青素粗提物组和多酚类化合物粗提物组的小鼠肿瘤体积均有显著性差异（p<0.05）。

图4-2 建模后小鼠肿瘤体积变化

Fig 4-2. Change of mouse tumor volume after modeling

4.3.3 蓝莓花青素、多酚类物质对Balb/c乳腺癌小鼠的抑瘤作用和对免疫器官的影响

从体重增长速度上看，除阳性对照组小鼠体重下降以外，其他各组小鼠的体重均有不同程度的增长，其中BBCM-HD的小鼠体重增速最快，另外BBAC-HD，BBPC-HD和BBCM-MD三组中小鼠的体重亦显著增加。同时从数据上可以看出，各试验组中，小鼠体重都随蓝莓提取物浓度的增加而增加，呈一定的量效关系。

从各组抑瘤率的数据上看，组内抑瘤效果有量效关系。抑瘤率较高的实验组分别为BBCM-HD，BBAC-HD和BBCM-MD，但这三组的抑瘤率都低于阳性对照组。根据小鼠体重数据，可以看出，阳性药物环磷酰胺可以很好的抑制肿瘤增长，但同时对小鼠机体造成了严重的伤害。相比之下，蓝莓提取物虽然在抑制肿瘤增长的效果上不如环磷酰胺，但是有效的提高了小鼠的机能。

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

表4-4 蓝莓提取物对模型小鼠肿瘤和免疫系统的影响

Table 4-4 Effects of blueberry extracts of tumor and immune system of mouse

model

分组

剂量（g/kg）

体重增加（g）脾指数（mg/g）

胸腺指数（mg/g）

瘤重（g）

抑瘤率（%）

N C

T C P C BBAC - HD BBAC - MD BBAC - LD BBAP - HD BBAP - MD BBAP - LD BBPC - HD BBPC - MD BBPC - LD BBPP - HD BBPP - MD BBPP - LD BBCM - HD BBCM - MD BBCM - LD —— —— 0.02 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05

6.02 ± 0.45 2.87 ± 0.31 -1.25 ± 0.18 a 5.23 ± 0.78 a 4.17 ± 0.47 a 3.75 ± 0.33 a 3.84 ± 0.46 a 2.63 ± 0.31 1.16 ± 0.14 4.87 ± 0.39 a 3.76 ± 0.42 a 2.60 ± 0.37 4.12 ± 0.36 a 3.58 ± 0.41 a 2.34 ± 0.14 5.87 ± 0.74 a 4.83 ± 0.51 a 3.83 ± 0.29 a

30. ± 3.66 17.23 ± 2. 17.67 ± 1.85 25.58 ± 3.46 a 23.91 ± 3.12 a 22.83 ± 3.73 a 22.26 ± 2.67 a 21.47 ± 1.96 a 6.23± 0.12 2. ± 0.39 3.51 ± 0.43 a 5.17 ± 0.47 a 4.49 ± 0.31 a 4.02 ± 0.53 a 4.67 ± 0.38 a 4.12 ± 0.34 a —— 0.74 ± 0.11 0.25 ± 0.04 a 0.42 ± 0.05 a 0.47 ± 0.06 a 0.55 ± 0.07 a 0.53 ± 0.10 a 0.65 ± 0.11

20.43 ± 1.67 a 3.69 ± 0.40 a 0.70 ± 0.14 25.37 ± 1.45 a 5.03 ± 0.42 a 0.48 ± 0.06 a 23.93 ± 2.17 a 4.58 ± 0.35 a 0.52 ± 0.03 a 22.36 ± 2.61 a 3.71 ± 0.26 a 0.57 ± 0.03 a 23.15 ± 3.12 a 4.24 ± 0.44 a 0.57 ± 0.04 a 22.43 ± 2.14 a 3.86 ± 0.28 a 0.61 ± 0.09 a 20.34 ± 1.65 a 27.42 ± 3.10 a 26.18 ± 2.92 a 24.66 ± 2.56 a

3.47 ± 0.33 a 5.46 ± 0.49 a 4. ± 0.52 a 3.90 ± 0.41 a

0.66 ± 0.12 0.36 ± 0.04 a 0.41 ± 0.06 a 0.47 ± 0.07 a

—— —— 66.21 43.24 36.49 25. 68 28.38 18.92 5.40 35.14 29.73 22.98 22.98 17.57 10.81 51.35 44.59 38.52

a：p<0.05，与阴性对照组TC相比

根据表4-2可以明显看出，各实验组小鼠胸腺和脾脏指数均显著高于阴性对照组（p < 0.05），说明蓝莓提取物可以在一定程度上缓解肿瘤对小鼠生长状况的影响。同时在各实验组内，胸腺和脾脏指数与提取物浓度存在量效关系。阳性药物组小鼠的胸腺和脾脏指数与阴性对照组相比无显著性差异，果较好的三组分别为BBCM-HD，BBAC-HD和BBPC-HD。

4.3.4 蓝莓花青素、多酚类物质对Balb/c乳腺癌小鼠迟发型超敏反应的影响

迟发型超敏反应是一种有T淋巴细胞介导超敏反应，这种反应的强弱可以通过小鼠两耳肿胀差别测量，测量结果可以间接反映出机体体内T淋巴细胞对半抗原发生免疫反应的强弱。

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

表4-5 蓝莓提取物对模型小鼠迟发性免疫(DTH)反应的影响 Table 4-5 Effects of blueberry extracts of DTH of model mice

剂量(g/kg) —— —— 0.02 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05

a：p < 0.05，与阴性对照组TC相比分组 N C T C P C BBAC - HD BBAC - MD BBAC - LD BBAP - HD BBAP - MD BBAP - LD BBPC - HD BBPC - MD BBPC - LD BBPP - HD BBPP - MD BBPP - LD BBCM - HD BBCM - MD BBCM - LD

DTH (mg) 3.52 ± 0.21 0.8 ± 0.11 1.1 ± 0.17 2.93 ± 0.36 a 2.57 ± 0.31 a 2.15 ± 0.27 a 2.10 ± 0.22 a 1.47 ± 0.19 a 1.35 ± 0.15 a 2.96 ± 0.33 a 2.62 ± 0.37 a 1.95 ± 0.24 a 2.46 ± 0.31 a 1.99 ± 0.22 a 1.75 ± 0.16 a 3.14 ± 0.44 a 2.71 ± 0.39 a 2.23 ± 0.19 a

从表4-3可以看出，与阴性对照组相比各实验组在迟发性免疫反应的强度上均有显著提高（p<0.05），说明蓝莓提取物可以有效的提高小鼠机体体内的T淋巴细胞的活力。各实验组内不同浓度的提取物在提高迟发型超敏反应强度上存在量效关系，效果最为明显的三组为BBCM-HD，BBAC-HD和BBPC-HD。

4.3.5小鼠脾淋巴细胞转化能力

从表4-6可以看出，阳性对照组和各实验组中淋巴细胞转化能力均显著提高（p<0.05）。在各实验组内，淋巴细胞转化能力会随着蓝莓提取物浓度的增加而得到提高，有一定的量效关系。其中提高效果比较显著的是BBCM-HD，BBAC-HD和BBAC-HD三组。

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

表4-6 蓝莓提取物对模型小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响

Table 4-6 Effect of blueberry extract on spleen lymphocyte transformation

capacity of the model mouse

分组 N C T C P C BBAC - HD BBAC - MD BBAC - LD BBAP - HD BBAP - MD BBAP - LD BBPC - HD BBPC - MD BBPC - LD BBPP - HD BBPP - MD BBPP - LD BBCM - HD BBCM - MD BBCM - LD 剂量(g/kg) —— —— 0.02 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 a：p < 0.05，与阴性对照组TC相比脾淋巴细胞转化能力（OD）

3.04± 0.25 a 0.17 ± 0.03 0.49 ± 0.09a 2.62 ± 0.23 a 1.69 ± 0.11 a 1.38 ± 0.14 a 2.34 ± 0.25 a 1.72 ± 0.19 a 1.31 ± 0.12 a 2.58 ± 0.33 a 1.73 ± 0.31 a 1.38 ± 0.09 a 2.26 ± 0.21 a 1.61 ± 0.23 a 1.29 ± 0.12 a 2.70 ± 0.19 a 1.92 ± 0.24 a 1.56 ± 0.09 a 4.3.6碳粒廓清实验（小鼠巨噬细胞吞噬能力测定）

有关研究表明[76]，巨噬细胞是机体抑制肿瘤生长的主要效应细胞，当机体内生长的肿瘤激活巨噬细胞后可直接被杀伤，巨噬细胞还可分泌NO、TNF-α等细胞因子发挥抗肿瘤效应并参与免疫调节。

根据巨噬细胞吞噬能力数据可以看出，除阳性对照组和个别实验组外，蓝莓提取物均能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬能力（p<0.05）。各实验组小鼠的巨噬细胞吞噬能力均随蓝莓提取物的浓度的升高而不断增加，呈一定的量效关系。其中，对小鼠巨噬细胞吞噬能力提高较显著的三组分别为BBCM-HD，BBAC-HD和BBAC-HD。

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

表4-7 蓝莓提取物对模型小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

Table 4-7 Effect of blueberry extract on macrophage phagocytic of the model

mouse

分组剂量(g/kg) 脾淋巴细胞转化能力（OD） N C —— 5.87± 0.57 a T C —— 2.69 ± 0.38 P C 0.02 3.03 ± 0.41 BBAC - HD 0.15 5.23 ± 0.44 a BBAC - MD 0.1 4.43 ± 0.48 a BBAC - LD 0.05 3.93 ± 0.39 a BBAP - HD 0.15 4.82 ± 0.55 a BBAP - MD 0.1 3.69 ± 0.32 a BBAP - LD 0.05 3.19 ± 0.47 BBPC - HD 0.15 5.22 ± 0.28 a BBPC - MD 0.1 4.59 ± 0.31 a BBPC - LD 0.05 3.76 ± 0.42 a BBPP - HD 0.15 4.91 ± 0. a BBPP - MD 0.1 4.06 ± 0.53 a BBPP - LD 0.05 3.42 ± 0.27 a BBCM - HD 0.15 5.46 ± 0.47 a BBCM - MD 0.1 4.93 ± 0.65 a BBCM - LD 0.05 3.68 ± 0.49 a a：p<0.05，与阴性对照组TC相比

4.3.7小鼠肝部、肺部组织中SOD活力及MDA含量

超氧化物歧化酶（SOD）是动物体内一种重要的抗氧化酶，可以将氧自由基转化成水等低毒性物质，对于减轻自由基对动物体的损伤起到非常重要的。针对SOD在抗肿瘤方面的研究非常多而且全面：SOD还可以防止自由基破坏正常细胞的遗传物质[77]；也有研究表明在正常细胞和癌细胞中，SOD的作用机制不同[78]；SOD活性的降低会导致大量积累的O2-杀死正常的细胞；SOD的加入可以促进黄芩苷的抗肿瘤活性[79]；自然状态存在下的肿瘤细胞中含有浓度较高的CuZn-SOD和Mn-SOD[80]。

丙二醛（MDA）是一种脂质过氧化产物，其在动物组织中的含量可以间接反映出机体受到氧自由基等离子伤害的程度，与SOD在不同的方面体现同一个问题，因此在实验过程中，对SOD和MDA的检测通常是同时进行的，本试验也同时采用了两个指标都进行测量的试验方法。

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

表4-8 蓝莓提取物对模型小鼠肝部组织SOD、MDA含量的影响

Table 4-8 Effect of blueberry extracts on SOD and MDA content of model mouse

liver

SOD (U/mgprot) MDA(nmol/mgprot) 分组剂量(g/kg) N C

T C P C BBAC - HD BBAC - MD BBAC - LD BBAP - HD BBAP - MD BBAP - LD BBPC - HD BBPC - MD BBPC - LD BBPP-HD BBPP-MD BBPP-LD BBCM-HD BBCM-MD BBCM-LD

—— —— 0.02 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05

323.93 ± 20.12 a 163.93 ± 11.45 b 112.46 ± 9.80 a b 278.97 ± 21.23 a 249.30 ± 15.90 a b 203.68 ± 11.46 a b 238.30 ± 21.78 a b 198.20 ± 14.18 a b 178.53 ± 9.62 b 265.80 ± 15.28 a 230.40 ± 14.71 a b 200.32 ± 9.93 a b 220.95 ± 15.69 a b 210.21 ± 15.65 a b 198.75 ± 8.79 a b 287.62 ± 16.74 a 2.53 ± 16.34 a 210.63 ± 19.52 a b

0.91 ± 0.17 a 3.19 ± 0.42 b 2. ± 0.31 a b 1.12 ± 0.22 a 1.68 ± 0.18 a b 2.17 ± 0.25 a b 1.73 ± 0.31 a b 1.97 ± 0.33 a b 2.39 ± 0.21 a b 1.29 ± 0.19 a 1.74 ± 0.27 a b 2.27 ± 0.34 a b 1.65 ± 0.09 a b 1.87 ± 0.24 a b 2.23 ± 0.35 a b 1.06 ± 0.15 a 1.42 ± 0.21 a 1.88 ± 0.17 a b

a：p<0.05，与阴性对照组TC相比 b：p<0.05，与正常组NC相比

表4-9 蓝莓提取物对模型小鼠肺部SOD活力及MDA含量的影响 Table 4-9 Effect of blueberry extracts on SOD activity and MDA content of

model mouse lung

SOD (U/mgprot) MDA(nmol/mgprot) 分组剂量(g/kg)

N C 1.04 ± 0.07 —— 205.4 ± 10.82 T C 4.56 ± 0.33 b —— 123.1 ± 7. b P C 4.23 ± 0.41 b 0.02 97.8 ± 5.21 b BBAC - HD 1.76 ± 0.15 a b 0.15 199.0 ± 9.82 a BBAC - MD 2.19 ± 0.33 a b 0.1 169.0 ± 6.78 a b BBAC - LD 2.88 ± 0.32 a b 0.05 131.2 ± 4.31 a b BBAP - HD 2.21 ± 0.25 a b 0.15 136.0 ± 6.14 a b BBAP - MD 2.45 ± 0.22 a b 0.1 126.0 ± 5.37 b BBAP - LD 2.92 ± 0.36 a b 0.05 112.0 ± 4.18 b BBPC - HD 2.00 ± 0.35 a b 0.15 179.0 ± 6.33 a b

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

续表4-9

BBPC - MD BBPC - LD BBPP - HD BBPP - MD BBPP - LD BBCM - HD BBCM - MD BBCM - LD 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05 0.15 0.1 0.05

151.0 ± 5.47 a b 133.8 ± 6.29 b 145.0 ± 5.44 a b 130.0 ± 3.19 a b 117.4 ± 4.37 b 202.0 ± 5.39 a 168.0 ± 7.62 a b 138.0 ± 3.71 a b

2.32 ± 0.31 a b 3.01 ± 0.28 a b 2.20 ± 0.19 a b 2. ± 0.36 a b 3.07 ± 0.41 a b 1.45 ± 0.21 a 2.11 ± 0.14 a b 2.61 ± 0.23 a b a：p < 0.05，与阴性对照组TC相比 b：p < 0.05，与正常组NC相比由表4-8、4-9可以看出：

1、与阴性对照组相比，除阳性对照组和个别纯化物低剂量组在提高小鼠肝部、肺部SOD活力上作用不显著（P > 0.05）外，其他各蓝莓提取物实验组都有显著的作用效果（P < 0.05），有效的改善了小鼠身体的内环境。部分实验组如BBCM-HD，BBAC-HD和BBAC-HD三组， SOD活力提高的幅度非常大，而且各组内提取物的作用效果随浓度的增加而增大，显示出明显的量效关系。值得注意的是，阳性对照组不仅没有改善小鼠肝部、肺部SOD活力，反而加剧了SOD活力的下降，说明环磷酰胺药物的小鼠机体伤害非常大。

2、与正常组相比，大部分实验组小鼠的肝部、肺部SOD活力的数据均有显著性差异（P < 0.05），说明，受到肿瘤的影响，患病小鼠的身体机能都有所下降。但部分实验组中如BBCM-HD和BBAC-HD两组中小鼠肝部、肺部SOD活力与正常组接近（P > 0.05）。说明这两组的蓝莓提取物有效的减轻了肿瘤对小鼠身体机能的影响。

3、与阴性对照组相比，除阳性对照组和个别蓝莓提取物纯化品低剂量组没有显著降低（P > 0.05）小鼠肝部、肺部MDA含量，其他各实验组均明显（P < 0.05）降低了MDA的含量，其中BBCM-HD，BBAC-HD和BBAC-HD作用尤其明显，各实验组内同样呈现明显的量效关系。

4、与正常组相比，各实验组中，仅BBCM-HD组小鼠的肝部、肺部MDA含量与正常组差距物显著性差异（P > 0.05），说明蓝莓粗提取物的混合物有效的降低了患病小鼠体内的脂质过氧化反应。

4.3.8 小鼠血清一氧化氮含量

一氧化氮参与的情况下，巨噬细胞可以不通过吞噬作用而直接将一些入侵的微生物杀死也能导致肿瘤细胞的凋亡[81]；一氧化氮也是动物体内重要的信号分子之一，在肿瘤患者体内可以介导细胞免疫能杀死肿瘤细胞[82]。但也有研究认为

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

NO的产生也会对免疫系统有抑制作用，作用为降低淋巴细胞的有丝，淋巴细胞增长，降低抗体和淋巴因子分泌量等。因此，一氧化氮的这种非特异性毒性作用将导致免疫功能降低，增加机体受到感染的可能性，进而引起器官和组织的广泛性损伤，成为许多疾病恶化的主要因素。

综上所述，一氧化氮在机体内的含量需要维持在一个适当的水平，才能发挥对机体有益的作用，相关研究表明，应用茶多酚联合维生素E和维生素C可以提高体内抗氧化酶的活性，降低血液中一氧化氮的水平[83]。

表4-10 蓝莓提取物对模型小鼠血清中一氧化氮含量的影响

Table 4-10 Effect of blueberry extracts on nitric oxide content in model mice

serum

分组

剂量(g/kg)

NO (μmol/ L) 6.7 ± 0. 39.62 ± 4.71 b 27.57 ± 2.33 a b 10.41 ± 0.99 a b 15.32 ± 1.21 a b 17.47 ± 1.44 a b 26.78 ± 1.69 a b 30.24 ± 2.78 a b 41.85 ± 3.61 b 10.92 ± 0.78 a b 16.42 ± 1.28 a b 19.56 ± 2.03 a b 19.47 ± 1.70 a b 24.52 ± 2.37 a b 33.66 ± 3.55 b 9.91 ± 0.76 a b 13.29 ± 1.45 a b 18.83 ± 2.01 a b

NC —— TC —— PC 0.02 BBAC - HD 0.15 BBAC - MD 0.1 BBAC - LD 0.05 BBAP - HD 0.15 BBAP - MD 0.1 BBAP - LD 0.05 BBPC - HD 0.15 BBPC - MD 0.1 BBPC - LD 0.05 BBPP - HD 0.15 BBPP - MD 0.1 BBPP - LD 0.05 BBCM - HD 0.15 BBCM - MD 0.1 BBCM - LD 0.05 a：p < 0.05，与阴性对照组TC相比 b：p < 0.05，与正常组NC相比

从以上数据可以看出，与正常组相比，阴性对照组、阳性对照组和各实验组中小鼠血清中一氧化氮的含量均显著升高（p<0.05）。导致这种情况的原因有两种，一是由于肿瘤细胞的增殖使得肿瘤周围器官组织破坏或发生感染，此时的组织细胞就会分泌能刺激合成一氧化氮的酶的合成，从而导致一氧化氮的含量的上升，二是肿瘤细胞本身引发免疫细胞的应答反应，这个过程中同样会导致一氧化

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

氮合酶的大量表达。但与阴性对照组相比，阳性对照组和各实验组均显著（p<0.05）遏制了一氧化氮的产生，而且在各实验组内有着明显的量效关系，抑制效果较好的三个组分别是BBCM-HD，BBAC-HD和BBAC-HD。

4.3.9 小鼠肺部、肝部组织HE染色

4.3.9.1 小鼠肺部组织HE染色

N C T C P C BBAC - HD BBAC - MD BBAC - LD BBAP - HD BBAP - MD BBAP - LD BBPC - HD BBPC - MD BBPC - LD 40

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

BBPP - HD BBPP - MD BBPP - LD BBCM - HD BBCM - MD BBCM - LD 图4-3 模型小鼠肺部组织HE染色 Fig 4-3. HE stain pictures of mouse model lung

由图4-3可以看出，正常小鼠肺部组织细胞分布均匀，肺泡大小适中且均匀分布在组织内。由乳腺癌模型小鼠的肺部组织切片可以看出，细胞聚集的现象比较明显，出现大量的黑色细胞团，肺泡外形轮廓不明显。由阳性对照组可以看出，小鼠肺部组织受到极大的破坏，细胞大量死亡，基本无肺泡结构。参考这三组肺部切片的形态，可以判断其他各实验组的小鼠肺部健康情况，其中符合无黑色细胞团聚集、活细胞数较多、肺泡大小适中并且分布均匀的几组分别为BBCM-HD、BBCM-MD、BBPC-HD、BBAC-HD和BBAC-MD组。 4.3.9.2 小鼠肝部组织HE染色

N C T C P C BBAC - HD BBAC - MD 41

BBAC - LD

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

BBAP - HD BBAP - MD BBAP - LD BBPC - HD BBPC - MD BBPC - LD BBPP - HD BBPP - MD BBPP - LD BBCM - HD BBCM - MD BBCM - LD 图4-4 模型小鼠肝部组织HE染色 Fig 4-4. HE stain pictures of mouse model liver

由图4-4可以看出，正常组肝细胞活细胞比例较大，细胞轮廓清晰可见且细胞间隙较明显。阴性对照组和阳性对照组的细胞死亡率较高而且细胞轮廓不可分辨，细胞无间隙。结合这三组切片，判断其他各实验组肝部健康状况可以看出，组织和细胞形态与正常组比较接近的几组分别为BBCM-HD、BBCM-MD、BBPC-HD、BBPC-MD、BBAC-HD和BBAC-MD组。

4.4 小结

癌症患者绝大多数伴有免疫机能受抑制和免疫器官萎缩的现象[84]，而在一般

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

的癌症治疗过程中，使用对癌症细胞和正常细胞伤害都很大的方法进行，而并不是通过改善机体免疫能力，增强机体自身免疫细胞杀死癌症细胞的能力来抑制癌症细胞的增殖和扩散。正如本研究的结果显示，一些常用的癌症治疗药物如环磷酰胺，对小鼠胸腺和脾脏这两个重要的免疫器官造成了极大的伤害，虽然能在一定程度上抑制肿瘤的生长，但是对患者身体机能造成的伤害也会使患者在其他病症上的抵抗能力严重下降。

在本研究过程中，各实验组中小鼠与阴性对照组小鼠相比，在体重、肿瘤抑制、身体力量、毛发色泽、饮食量和精神状态等方面都有很大的改善。虽然在肿瘤抑制率上低于阳性对照组，但是各实验组中小鼠并没有表现出阳性对照组小鼠反应迟钝，发抖和食欲不振的情况。说明，蓝莓提取物可以在一定程度上减轻肿瘤对机体的损伤，在抑制肿瘤的同时并不会对小鼠正常组织器官和内环境造成损坏。

本实验对小鼠多种免疫指标（胸腺指数、脾脏指数、迟发型超敏反应、巨噬细胞吞噬能力和淋巴细胞转化能力）进行了检测，结果发现，蓝莓提取物在这些方面都对患病小鼠有很大的提高和改善，阳性对照组的环磷酰胺药物对小鼠免疫器官和免疫能力造成的巨大损伤，伤害程度和阴性对照组类似，并在部分免疫指标上，阳性对照组对免疫能力造成的损伤更严重。在各实验组中，蓝莓提取物对免疫能力的改善随着提取物浓度的增加而不断增加，部分实验组如BBCM-HD，BBAC-HD和BBAC-HD等，对小鼠机体免疫能力的提高十分明显，非常接近正常组小鼠。

在体内环境检测中，各实验组中小鼠肺部和肝部的SOD活力较阴性对照组小鼠明显增加，有效的改善了患病小鼠体内的抗氧化能力。同时小鼠肺部和肝部的检测数据显示，各实验组的小鼠体内MDA的含量较阴性对照组偏低，亦说明蓝莓提取物在一定程度上抑制了患病小鼠体内的脂质过氧化反应。对小鼠血清中一氧化氮含量的检测发现，各实验组有效的降低了血清中一氧化氮的含量，这说明蓝莓提取物不仅可以减轻肿瘤扩增对组织造成损伤后引发的炎症反应，而且降低了肿瘤细胞的供血量。

结合体外抑制肿瘤增殖实验并比较各个试验组的数据，可以发现通过灌胃的方式用蓝莓提取物对患肿瘤小鼠进行治疗，提取物经过小鼠消化系统的消化作用后，依然具有较好的抑制肿瘤的作用，这种作用不仅不会引起正常组织和器官的损伤，而且还可以有效的改善小鼠的免疫水平和内环境。还可以发现，不同种类和不同浓度的提取物产生的效果不尽相同，但是也有一定的规律：蓝莓花青素和对酚类化合物的粗提物以及粗提物的混合物对患病小鼠的各种生理指标的改善非常明显，这个实验结论与体外肿瘤抑制实验的结论一致，可以分析出，蓝莓花

第四章蓝莓花青素及多酚类物质体内抗肿瘤活性

青素和多酚类物质对肿瘤有一定的抑制作用，而这种抑制作用在其他物质如蛋白质和多糖类的参与下会得到更明显的效果。

第五章蓝莓花青素及多酚类物质中主要成分分析

蓝莓花青素和多酚类化合物中都含有多种具有抗氧化性等生物活性的物质，为了探究这些物质的结构和生理功能之间的关系，本部分实验对蓝莓花青素和多酚类化合物的纯化品进行了高效液相色谱-质谱联用分析。本部分实验并未对两种活性物质的粗提物进行分析，因为在粗提物中存在的蛋白质和多糖类化合物会对HLPC-MS的检测结果造成较大影响，而在用AB-孔吸附树脂获得纯化物的过程中这些物质已经除去，增加了分析的精度。

5.1 实验材料 5.1.1 药品和试剂

表5-1实验药品和试剂

Table 5-1 Experimental Chemicals & Reagents

试剂名称公司甲醇（色谱纯）天津江天化学试剂有限公司

双蒸水 —— 甲酸天津江天化学试剂有限公司

针膜（有机相45μm）上海密粒膜分离技术有限公司滤膜（有机相45μm）上海密粒膜分离技术有限公司

5.1.2 实验仪器

表5-2实验仪器

Table 5-2 Experimental Apparatus

仪器名称型号公司超声清洗剂 TDL - 5 上海安亭科学仪器厂过滤器 PHS - 3B 上海精科真空泵 BS - 124S Straurous 液相-质谱联用仪 BD - 198E 海尔高效液相色谱仪安捷伦1100 安捷伦仪器公司

C 18柱 Phenomenex Luna 5μ

第五章蓝莓花青素及多酚类物质中主要成分分析

5.2 试验方法

5.2.1 高效液相色谱及液相色谱-质谱联用技术

高效液相色谱（HPLC）：是一种先进的色谱分析技术，以液体为流动相，具有需样量少、分析速度快灵敏度高等特点，对于分子量较大，沸点较高和受热后稳定性较差的物质的分析来说非常适用，尤其是在天然色素类[85]的分离分析的应用上十分广泛且非常有效。

液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）：液相色谱-质谱联用技术因其应用范围广、自动化程度高、检测精度高和速度快等特点，在化合物分析领域得到越来越广泛的应用。快近年来LC-MS/MS技术被用来检测龙眼[86]、梨和苹果等[87]水果中的酚类物质。

5.2.2 液质联用分析用蓝莓花青素及多酚类化合物的制备

将少量的经过AB-孔吸附树脂纯化的蓝莓花青素用酸化甲醇（0.5%HCL）溶解，多酚类化合物用乙醇溶解，进样前，两种溶液均用45μm微孔有机针膜过滤，样品溶液应避光冷藏。

5.2.3 蓝莓花青素及多酚类化合物液相分析条件

蓝莓花青素液相-质谱联用所用流动相为：A相：甲醇；B相：浓度为5%甲酸溶液；流速：0.3mL/min，进样量2μL，检测波长为516nm。

表5-3蓝莓花青素液相-质谱联用洗脱条件

Table 5-3 Design of elution of HPLC-MS condition of blueberry anthocyanins

T（min） 0 10 25 70 95 120 A:B(V/V) 3:97 40:60 50:50 50:50 80:20 100:0

蓝莓多酚类化合物液相-质谱联用所用流动相为：A相：甲醇；B相：浓度为0.5%甲酸溶液；流速：0.2mL/min，进样量2μL，检测波长为280nm。

第五章蓝莓花青素及多酚类物质中主要成分分析

RT:0.00 - 120.02SM:5B1009590858075706560Reatve Abundance12.72NL:2.20E7Base Peak F: - c ESI Full ms [ 200.00-500.00] MS 20120529-lanmeihqs5550403530252013.25151051.813.7000510152025303045505560Time (min)6570758085909510010511011512014.3215.3031.2918.3825.5228.4380.7882.58.88.32.7038.5843.9248.8050.8655.5061.2866.0267.6372.9275.9993.48100.5995.0798.30107.74117.28111.84116.856.288.5511.2922.6720.67118.38107.09

图5-1 蓝莓花青素液相图谱

Fig 5-1. HPLC Graph of blueberry anthocyanins

表5-4 蓝莓多酚类化合物液相-质谱联用洗脱条件

Table 5-4 Design of elution of HPLC-MS condition of blueberry polyphenols

T（min） 0 10 20 50 70 A:B(V/V) 10:90 20:80 30:70 40:60 50:50

RT:0.00 - 120.02SM:5B1009590858075706560Reatve Abundance91.26NL:1.27E9Base Peak F: + c ESI Full ms [ 200.00-500.00] MS 20120529-lanmeihqs55504035115.2430252015104.08500510152025303045505560Time (min)657075808590951001051101151201.946.2612.6914.4917.1622.1023.1429.3631.1738.22.1844.27.4151.7453.3658.61.41.2368.6171.9986.6776.7277.2884.26.528.5811.12110.2992.9195.09106.7298.33113.98118.11100.47

图5-2 蓝莓多酚类化合物液相图谱 Fig 5-2. HPLC Graph of blueberry polyphenols

第五章蓝莓花青素及多酚类物质中主要成分分析

5.2.4质谱条件

采用点喷雾离子化[ESI]法；离子源温度110℃；负离子扫描；扫描范围100-1000amu；毛细管电压128.5V；锥孔电压40V。脱溶剂气（N2）流速350L/h，锥孔气（N2）流速350L/h。

5.3 一级质谱对蓝莓花青素解析

分别在：6.28 min、8.55 min、11. 29 min、 12.72 min、13.25 min、14.32 min、15.30 min、18.38 min、20.67 min、22.67 min、31.29 min、. min、95.07 min、98.30 min有14个吸收峰。

按保留时间各峰分别编号为1-14.

表5-5 蓝莓花青素HLPC-ESI-MS定性分析结果

Table 5-5 Analysis of blueberry anthocyanins by HLPC-ESI-MS

编号保留时间（min）分子离子峰相对分子质量推测化合物

天竺葵素-3-O-半乳糖苷 1 6.28 433（M-H+） 434

槲皮素-3-O-半乳糖苷 2 8.55 461（M-H+） 462

绿原酸异构体 3 11. 29 353（M-H+） 3

Uncertain 4 12.72 430（M+） 430

Uncertain 5 13.25 430（M+） 430

表儿茶素没食子酸脂 6 14.32 444（M+） 444

锦葵素-3-O-葡萄糖或己7 15.30 495（M-H+） 496

糖

9 10 11 12 13 14

18.38 20.67 22.67 31.29 . 95.07 98.30

393（M-H+） 3（M+） 432（M+） 345（M-H+） 357（M-H+） 341（M+H+） 438（M+） 484（M+）

394 3 432 346 358 340 438 484

Uncertain Uncertain 山奈酚-3-鼠李糖苷 5-没食子酸奎宁酸阿魏酸己糖脂 Uncertain Uncertain 杨梅酮-3-O-己糖

5.4 一级质谱对蓝莓多酚类化合物的解析

蓝莓多酚类化合物一级质谱保留时间为4.08、6.26、8.58 、11.12、12.69、

第五章蓝莓花青素及多酚类物质中主要成分分析

86.67、.52、91.26、106.72、110.29、113.98、115.24、118.11处有较为明显的吸收峰。按保留时间将各峰编号为1-13.

表5-6 蓝莓多酚类化合物HLPC-ESI-MS定性分析结果 Table 5-6 Analysis of blueberry polyphenols by HLPC-ESI-MS

编号保留时间（min）分子离子峰相对分子质量推测化合物

Uncertain 1 4.08 207（M-H+） 208

槲皮素-3-O-己糖 2 6.26 435（M+H+） 434

槲皮素-3-O-半乳糖苷 3 8.58 463（M+H+） 462

Uncertain 4 11.12 491（M+H+） 490

锦葵素-3-阿拉伯糖苷-5-5 12.69 369（M-H+） 370 6 7 8 9 10 11 12 13

86.67 .52 91.26 106.72 110.29 113.98 115.24 118.11

249（M-H+） 279（M-H+） 279（M-H+） 280（M+） 282（M+） 285（M-H+） 291（M-H+） 291（M-H+）

250 280 280 280 282 286 292 292

葡萄糖苷 Uncertain Uncertain Uncertain Uncertain Uncertain 香蜂草苷表儿茶素表儿茶素

5.5 小结

目前已有许多关于花青素种类及结构的报道，其中，花青素基本结构是一个三碳结构连接两个苯环，有时会结合一个非配醣体，例如天竺葵色素、花翠素、锦葵素和失车菊素等。多酚类物质是因其中含有多个酚基而得名，常见的多酚类物质主要是儿茶素和茶多酚。

实验结果显示，蓝莓花青素中含有的物质较多，其中主要有天竺葵素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、绿原酸异构体、锦葵素-3-O-葡萄糖或己糖、山奈酚-3-鼠李糖苷和杨梅酮-3-O-己糖等物质，有几种物质和之前的报道相一致，但也含有一些特殊物质。

蓝莓多酚化合物中确定的物质种类较少，但其中含有较多的表儿茶素也得到证实，多酚化合物中也含有一些结构与花青素类物质相似的物质，比如：槲皮素-3-O-半乳糖苷和锦葵素-3-阿拉伯糖苷-5-葡萄糖苷。

因此可以推测，蓝莓花青素与多酚类物质所含的物质的种类和结构都具有一定的差别，而这些差别可能会导致两种活性物质的功能及作用机理的不同；由于

第五章蓝莓花青素及多酚类物质中主要成分分析

两种活性物质中的一些成分中都含有相同的3-O-己糖或戊糖苷这种结构，也不排除两种活性物质中主要的功能结构就是这种特殊结构的可能性。

第六章全文总结与展望

第六章全文总结及展望

6.1全文总结

本文以蓝莓中一个品种蓝丰作为研究材料，研究了蓝丰中花青素和多酚类化合物这两种主要活性物质的体外抗氧化能力、体外抑制乳腺癌增值能力和对小鼠乳腺癌模型的治疗效果同时运用液质联用技术对两种化合物的主要成分和结构进行了分析，得到结论如下：

1、通过不同的提取和提纯方法得到了蓝莓花青素和多酚类化合物两种物质的粗提物和纯化品，四种物质均有较强的还原能力、ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力。经AB-孔吸附树脂纯化后得到的纯化品的抗氧化能力得到很大的提高。

2、在体外应用MTT法比较蓝莓四种提取物的抑制人体乳腺癌细胞的增殖能力，发现蓝莓花青素和蓝莓多酚类化合物体外抑制肿瘤增殖的原理不同，提取物抑制肿瘤增殖的能力与其抗氧化能力之间不存在明显的正相关的关系。

3、对小鼠进行体内抗CD-1乳腺癌实验，通过小鼠生理特征的观察，测定体重、肿瘤体积、抑瘤率、脾指数、胸腺指数、脾淋巴细胞增值能力、碳粒廓清速率、迟发型免疫反应和SOD活力、MDA和NO含量等一系列免疫指标和抗氧化能力的测定，鉴定出蓝莓的四种提取物具有一定的体内抗肿瘤活性。

4、对蓝莓花青素和多酚类化合物的物质成分和物质结构的分析结果显示：蓝莓花青素和多酚类物质所含的主要物质的种类和结构有较大的差别，但他们之间也含有部分相同的结构。

6.2 展望

本文成功的探讨了蓝莓花青素和多酚类物质的抗氧化能力与其对于乳腺癌抑制作用之间的关系，初步分析出了这两种活性物质作用机理的不同之处。

在以后的研究中应对蓝莓中与这两种活性物质起到协同作用的其他功能成分进行分析；探究这两种活性物质的特殊结构与抑制肿瘤细胞之间的关系；同时还可以从蓝莓中分离出更多更单一的功能成分和对其他常见疾病进行治疗等方面对蓝莓的研究进行完善。

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发表论文和科研情况说明

发表的论文：

[1] Xing Yuan Li, Bing Xie, Wen Lan Guo, Run Zi Guo, Xiao Hong Kou, Extraction and Purification of Asparagus Oligosaccharides. Journal of Asvanced Materials Research, 2012. p. 1886-12.

附录

一级质谱对蓝莓多酚类化合物的解析

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附录

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附录

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附录

20120529-lanmeihqs #532-1RT:13.37-13.56AV:5SB:213.17, 13.81NL:6.19E7F:+ c ESI Full ms [ 200.00-500.00]249.11009590858075706560Relative Abundance5550403530252015105202.50200217.2215.2210219.3235.2233.2236.3242.3230240251.22.6272.2283.1292.1280290295.0300317.3321.9310.1310320250.2266.2271.2294.2365.0346.0334.4337.0362.5355.6340.9330340350m/z360378.9386.2391.3378.4393.3369.1370380390437.1435.2453.3418.8460.2470.0465.9450460470480480.7490.3490499.7500404.1400411.0410424.7439.1220250260270420430440

20120529-lanmeihqs #3555-3574RT:.22-.67AV:10SB:188.09, 90.16NL:5.38E7F:+ c ESI Full ms [ 200.00-500.00]279.21009590858075706560Relative Abundance55504035301.3302520280.315105207.2211.0216.4234.20200210220230236.3239.3250260.5262.7302.3277.6270.7270281.2288.9294.3290300306.3310311.1324.2319.1320333.2341.9343.0340350m/z357.1360366.2370379.1378.2380386.2395.8399.2400410408.9394.8411.0428.1431.0443.3446.94.1458.8430440450460474.0478.70480488.3490497.8500240260280330390420

附录

20120529-lanmeihqs #3630-36RT:91.11-91.46AV:8SB:290.46, 92.76NL:1.15E9F:+ c ESI Full ms [ 200.00-500.00]279.21009590858075706560Relative Abundance5550403530252015105205.10200211.3222.4227.7210220230237.7242.1240250255.3260272.4270278.1394.8281.3282.3280290296.1300302.3314.0310324.1320337.7330341.5340378.8343.9350m/z363.3369.0360370380429.3386.0390395.9400408.8415.1422.1410420430438.4440448.0453.3461.67.2450460470482.1480493.3490500280.3301.2437.4

20120529-lanmeihqs #4241-4272RT:106.32-107.07AV:16SB:1105.37, 107.NL:5.35E7F:+ c ESI Full ms [ 200.00-500.00]280.41009590858075706560Relative Abundance5550403530252015105206.60200210219.2220227.3230235.3243.4248.4240250279.3262.3268.3278.4260270280282.4283.7290302.4303.4298.5300310315.4316.4324.3320330335.2352.5340350m/z356.6281.53.5365.4373.6370381.2391.3397.0399.14.4422.2410420432.3436.46.8430440450457.4460466.3470477.2480488.2499.6500360380390400490

附录

20120529-lanmeihqs #4396-4409RT:110.19-110.49AV:7NL:3.38E8F:+ c ESI Full ms [ 200.00-500.00]1009590858075706560Relative Abundance282.45550403530252015105203.20200210217.2219.2220230235.3240247.4251.1265.5269.5250260270279.2280284.6290304.4301.2305.4314.4323.1300310320333.7341.13303403.6357.2350m/z360366.4377.0382.5380391.3390398.1400408.1414.1417.2410420434.42.1430440450458.7462.60473.1484.1487.95.3470480490500283.6370

20120529-lanmeihqs #4537-4563RT:113.63-114.27AV:14SB:2113.00, 114.52NL:4.52E7F:+ c ESI Full ms [ 200.00-500.00]284.61009590858075706560Relative Abundance5550403530252015105203.10200210217.3220230236.2240247.2250258.5260269.4270283.6280408.5228.3286.8292.1290300301.2311.0310325.2316.2326.0340.6344.4317.2320330340350m/z358.2285.7371.0377.6383.6385.8370380390399.9400410414.8421.4425.20430438.0440446.56.61.1468.3476.0450460470480487.9495.7490500360

附录

20120529-lanmeihqs #4598-4615RT:115.15-115.53AV:9SB:1114.59, 116.40NL:3.21E8F:+ c ESI Full ms [ 200.00-500.00]1009590858075706560Relative Abundance391.5555040353025201510414.65204.80200210217.2227.2231.4220230242.1247.3240250260.72.9260278.4281.3270280290295.2298.7300315.0319.5325.1310320330339.4343.2340350m/z356.5362.5360371.0370390.3384.1388.9380390393.4394.0397.0400412.8410420415.26.9430450.44.2450481.2480392.13.36.404.4460476.7470491.9498.7490500

一级质谱对蓝莓花青素解析

RT:0.00 - 120.02SM:5B1009590858075706560Relative Abundance12.72NL:2.20E7Base Peak F: - c ESI Full ms [ 200.00-500.00] MS 20120529-lanmeihqs5550403530252013.25151051.813.7000510152025303045505560Time (min)6570758085909510010511011512014.3215.3031.2918.3825.5228.4380.7882.58.88.32.7038.5843.9248.8050.8655.5061.2866.0267.6372.9275.9993.48100.5995.0798.30107.74117.28111.84116.856.288.5511.2922.6720.67118.38107.09

附录

20120529-lanmeihqs #238-257RT:6.03-6.48AV:10NL:6.27E6F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]205.11009590858075706560Relative Abundance555040333.130252015105207.20200210212.3225.2220230235.1246.9250.6240250263.1260270274.1280206.1273.1434.1290.1287.0291.2290303.2312.1316.9300310320325.1334.9330340.9352.0340350m/z357.8360410.9363.2370375.0379.1386.8380390402.9400410411.8420432.3430435.1440449.0450455.04.9470.9460470478.8480494.8490.9495.9490500

20120529-lanmeihqs #328-344RT:8.31-8.70AV:9SB:17.83, 8.95NL:5.75E6F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]2.71009590858075706560Relative Abundance219.15550403530252015105221.0201.2217.2227.60200210220230240.9240461.0220.1265.9263.7304.1263.0253.0259.8250260266.8270279.1280287.0290294.9300305.1310316.9320331.0333.1330340347.03.3350m/z362.3368.7374.0360370380384.9394.8400.3404.9390400410419.0423.0420433.9440.2430440449.8458.0450460462.1463.0470477.0480486.9492.8499.90500

附录

20120529-lanmeihqs #394-407RT:9.95-10.25AV:7NL:2.55E6F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]1009590858075706560Relative Abundance398.955504035302520399.915105205.10200219.1214.2210220226.9230235.0243.0240249.12503.22.9260.0266.0260270277.1280286.9290299.1300311.0317.0310320328.1330341.1344.9340350m/z356.9360375.1378.83703803904003.0397.2411.1422.1400.9403.0410420423.1430.0430439.1440.3440452.9467.0482.9482.04.8496.1490500488.7398.3353.1438.1421.0416.0450460470480

20120529-lanmeihqs #448-4RT:11.29-11.69AV:9NL:2.39E6F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]1009590858075706560Relative Abundance278.8233.15550404.13530428.0252015318.1105209.50200234.2279.9280.9291.1280290300311.0316.8319.1327.0310320330353.1347.2345.1340350m/z363.1359.0360365.0380.2373.1370380386.0392.8369.0399.2410.0402.2277.4215.0219.1232.3231.5210220230243.1249.0259.92.8240250260276.5270410.9444.9301.2401.0435.1462.1437.1446.1448.0459.0430440450460468.9479.8421.0400410420478.8490.1498.9490500412.0415.0424.9390470480

附录

20120529-lanmeihqs #499-511RT:12.57-12.81AV:6SB:112.30, 13.05NL:1.95E7F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]1009590858075706560367.3Relative Abundance429.9412.755504035302520113.81050200210.9219.7226.5233.0210220230242.7240253.3261.0250260270279.4280290295.4300305.4311.1310324.9330.2320330339.3340351.2356.8366.3350m/z360369.3370380402.1388.9397.2390400410414.9420368.3411.05.1429.3425.30432.0441.9440452.1450470.8459.70.1460470472.7480481.8482.9496.2500497.7403.0480.7431.0490

20120529-lanmeihqs #527-532RT:13.25-13.34AV:3SB:213.10, 13.49NL:4.78E6F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]1009590858075706560Relative Abundance412.9430.05550403.1403530424.8252015105208.60200210222.1228.7220230240248.92.92502602.8270275.7280285.9292.9290300311.0310320327.6333.8330340345.0350m/z361.2357.2360370368.3379.1383.1380402.4392.3398.9390400410414.7422.8420430440451.9450457.9460469.12.1413.9367.3480.05.1431.0441.8470.72.7497.7481.4492.87.1480490500470

附录

20120529-lanmeihqs #568-577RT:14.22-14.42AV:5SB:113.95, 14.61NL:2.71E6F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]100959085807570626.860Relative Abundance444.0555040317.0302520127.910382.35206.40200210219.9220226.1232.9230243.1240257.9250260.0260272.9276.0270280291.0290301.0307.8300310316.9320325.0329.1330370.8343.0346.9358.0366.4340350m/z360370380391.8399.0390400410.0412.2445.9428.36.7420430440453.04504604.8425.0484.7480.8476.2470480486.7490495.8498.6500445.0426.1494.7381.3410

20120529-lanmeihqs #599-612RT:15.00-15.30AV:7SB:214.86, 15.40NL:6.58E5F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]1009590858075706560Relative Abundance393.2555040353025201510351.05209.30200210215.1219.0220232.9239.0244.0240250277.0258.8260270.8293.0280290294.9304.7312.0317.0324.0334.0347.13.2372.0378.9362.5394.2408.9426.0455.9476.8433.0363.2395.1408.1412.0403.0385.0425.0443.8420.7436.2447.8456.9461.0475..8466.9477.9485.9491.0480.8495.8493.8230270300310320330340350m/z360370380390400410420430440450460470480490500

附录

20120529-lanmeihqs #826-835RT:20.62-20.82AV:5SB:120.27, 21.30NL:3.61E6F:- c ESI Full ms [ 200.00-500.00]1009590858075706560Relative Abundance495.25550403530252015105200.7206.5219.00200210220232.0230242.9240250.0250262.3266.0260270274.9279.1280294.1290300305.1313.0317.6325.2310320334.0340.0340351.0350m/z363.0368.0360370374.8380384.9386.9404.7406.9409.7390400410425.8420430.0430440.8440450457.7461.9460470.9470480485.2490500493.2497.1496.2330

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附录

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附录

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附录

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致谢

至此论文完成之际，谨向毕业设计期间所有给予我指导和帮助的老师和同学们表达我最诚挚的谢意。

特别感谢我的导师寇晓虹副教授，在我的课题选择到实验进行到最终的论文写作，寇老师一直十分关心并在我遇到困难的时候给予我悉心的指导，使我能顺利完成毕业课题。在科研过程中，寇老师严谨、务实和全面分析问题的科研精神一直影响着我，我也在实验过程中不断培养这些精神，努力向老师看齐。在学习中，寇老师一直要求我们要始终积极向上，不断的超越自己，同时她也用自己的亲身经历来激励我们努力朝着更高更远的目标前进，这将会是我们一生的财富，相信在未来的工作中我也会谨记老师的教诲，不断创造属于自己的奇迹。在生活中，寇老师的宽容、亲切和平易近人的性格，为我们营造了家一样的实验室氛围，让我们能在这样一个和睦、轻松和温暖的环境中度过难忘的研究生生活，我也希望能像毕业的师兄师姐那样，每年中秋能回到这个大家庭看看。

同时要感谢同一课题组的薛照辉副教授，在我的实验过程中，薛老师多次提出中肯的建议并亲力亲为为我解决了许多难题，借此机会向薛老师表达谢意。

同时要感谢食品科学专业肖华志老师在实验仪器方面为我提供的帮助以及张丽霞老师在液相使用方法上对我的耐心指导，感谢化工学院乔斌老师在我进行液质实验时对我的耐心帮助。

感谢实验室的师兄师姐高捷、王君、吕雅楠和王云鹏，在我刚入学的时候为我解答许多迷惑，让我逐步适应了研究生生活，在我实验刚开始的阶段，他们不厌其烦的向我传授自己的实验经验和技巧，让我的毕业课题有了一个顺利的开端。

感谢我的实验室同窗王华、郭润姿和郭文岚，在试验中，他们总能在我遇到困难的时候伸出援助之手，无私的、全力的帮助我。在这两年多的生活中，我们共同营造了和谐融洽的实验室氛围，和他们在一起的日子很快乐。

感谢我可爱的师弟师妹张莹、王爽、彭吕杨、胡冬梅、翟丽娟、吴梦诗、陈琼和李娇妹，感谢你们给予我的帮助，给我带来的温暖。

最后，感谢我的父母这些年来对我的养育和教育的恩情，他们默默的付出我都看在眼里记在心里，纵使千言万语也不足以表达我的感激之情，在以后的生活中，我一定努力向上，积极进取，尽最大的努力让他们过上幸福的生活。

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