一种人热休克蛋白gp96的制备方法及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104372025 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.02.25

(21)申请号 201410498405.2(22)申请日 2014.09.25

(71)申请人中国科学院微生物研究所

地址100101 北京市朝阳区北辰西路1号院

3号(72)发明人孟颂东 赵报 刘炜炜 邓蒙蒙

陈立钊(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限

公司 11245

代理人关畅 陈晓庆(51)Int.Cl.

C12N 15/866(2006.01)C07K 14/435(2006.01)C07K 1/18(2006.01)C07K 1/16(2006.01)A61K 39/39(2006.01)A61P 31/20(2006.01)

()发明名称

一种人热休克蛋白gp96的制备方法及其应用(57)摘要

本发明公开了一种人热休克蛋白gp96的制备方法及其应用。本发明公开一种制备人热休克蛋白gp96的方法，是在昆虫细胞中表达人热休克蛋白gp96。采用本发明公开的昆虫细胞表达系统表达的人热休克蛋白gp96不结合抗原多肽，因此可以更好的与HBcAg和HBsAg结合，从而增强了其免疫学功能，由此昆虫细胞分泌表达的人热休克蛋白gp96作为佐剂研制的乙肝治疗性疫苗，可大幅提高乙肝治疗性疫苗的抗HBV疗效。 C N 1 0 4 3 7 2 0 2 5 A权利要求书2页 说明书14页

序列表6页 附图4页

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权 利 要 求 书

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1.一种制备人热休克蛋白gp96的方法，是在昆虫细胞中表达人热休克蛋白gp96。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述在昆虫细胞中表达人热休克蛋白gp96的方法为将人热休克蛋白gp96的编码基因导入昆虫细胞中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述人热休克蛋白gp96的编码基因是通过如下(1)或(2)所述的方法导入的：

(1)通过重组昆虫病毒表达载体导入所述昆虫细胞；(2)通过重组昆虫病毒导入所述昆虫细胞；

所述重组昆虫病毒是通过所述重组昆虫病毒表达载体在昆虫细胞中表达或传代得到的。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述重组昆虫病毒表达载体为可在细菌和昆虫细胞之间转移和扩增的病毒穿梭质粒。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述病毒穿梭质粒为杆状病毒穿梭质粒；

所述杆状病毒穿梭质粒具体是将人热休克蛋白gp96的编码基因或SEQ ID No.3所示的DNA分子插入pFastBacTM 1质粒的EcoRI和XbaI酶切位点间，得到中间载体1；将中间载体1转化DH10BacTM E.coli，得到重组质粒，即得；

所述pFastBacTM 1质粒和所述DH10BacTM E.coli均包含在

Baculovirus

Expression System试剂盒中，该试剂盒购自Invitrogen，产品目录号为10359-016。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述在昆虫细胞中表达人热休克蛋白gp96之后还包括将表达人热休克蛋白gp96的昆虫细胞培养液离心收集上清、过滤的步骤。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述过滤后还包括将滤液进行离子交换层析和分子筛层析的步骤；

所述离子交换层析具体为HiTrap-Q Sepharose离子交换层析；所述分子筛层析具体为Superdex 20010/300GL分子筛层析；所述HiTrap-Q Sepharose离子交换层析的具体步骤如下：(a)将所述过滤得到的滤液上样HiTrap-Q Sepharose层析柱，流速为1ml/min；(b)用含有200mM NaCl的pH7.5的PBS洗脱缓冲液洗脱步骤(a)的层析柱，流速为1ml/min，洗去非特异性结合的蛋白；

(c)用含有300mM NaCl的pH7.5的PBS洗脱缓冲液洗脱步骤(b)的层析柱，流速为1ml/min，洗去杂蛋白；

(d)用含有600mM NaCl的pH7.5的PBS洗脱缓冲液洗脱步骤(c)的层析柱，流速为1ml/min，收集洗脱液，将其命名为洗脱液1；

所述滤液的上样体积具体为800ml；

所述步骤(b)和(c)中的洗脱体积具体为5个柱体积以上；所述Superdex 20010/300GL分子筛层析的具体步骤如下：(e)将洗脱液1上样Superdex 20010/300GL层析柱，流速为0.25ml/min；(f)用pH7.5的PBS缓冲液洗脱步骤(e)的层析柱，流速为0.25ml/min，用280nm进行检测，收集含有分子量为100-130KDa的蛋白的洗脱峰，即为所述人热休克蛋白gp96；

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权 利 要 求 书

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所述洗脱液1的上样体积具体为1ml。

8.由权利要求1-7任一所述的方法制备得到的人热休克蛋白gp96。9.一种疫苗，该疫苗含有权利要求8所述的人热休克蛋白gp96；或，

一种疫苗，该疫苗含有免疫佐剂和免疫原，免疫佐剂为权利要求8所述的人热休克蛋白gp96，免疫原为HBc149和/或HBsAg。

10.权利要求8所述的人热休克蛋白gp96在制备免疫佐剂中的应用；或，

权利要求8所述的人热休克蛋白gp96在制备疫苗中的应用；所述疫苗具体为乙肝疫苗；或，

权利要求8所述的人热休克蛋白gp96在制备预防和/或治疗乙肝病毒引起的疾病的产品中的应用。

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说 明 书

一种人热休克蛋白gp96的制备方法及其应用

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技术领域

[0001]

本发明涉及一种人热休克蛋白gp96的制备方法及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

尽管通过接种乙型肝炎病毒(HBV)疫苗，能够有效的预防HBV的发生。但是目前全世界仍有3.5亿HBV携带者，仅在中国就有9300万人为HBV携带者，大约15-40％的慢性乙肝感染者可能发展成致命的疾病，例如肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌等，慢性乙肝感染严重危害公众健康。现有的用于慢性乙肝患者的治疗方法包括IFN-α和核苷或核苷类似物(如拉咪呋啶、阿德福韦和恩替卡韦)，这些方法的治疗成本高，只有部分效果，而且会引起突变增加HBV耐药性。因此，迫切需要开发新的治疗性疫苗以补充或替代现有的抗病毒治疗方案。由于清除HBV病毒主要是由病毒特异性杀伤性T细胞(CTL)和辅助性T细胞反应介导，慢性病毒感染的特征是T细胞反应低下，所以T细胞特别是病毒特异性CTL在控制和清除病毒感染方面起着重要作用。

[0003] 乙肝核心抗原(HBcAg)和乙肝表面抗原(HBsAg)是HBV病毒的主要结构蛋白。之前的研究表明与那些慢性感染患者体内微弱的和单一的T细胞反应形成对比，在成功清除HBV的急性感染患者中，能够检测到多种靶向病毒核心抗原(HBcAg)和表面抗原(HBsAg)抗原表位的特异性CD8+T(即CTL)细胞，说明HBcAg和HBsAg特异性CTL细胞反应在控制HBV感染能力方面具有重要作用,而且有研究报道HBV侵染过程中，HBcAg特异性CTL与病毒控制相关。

[0004] HBc149是去除了HBcAg C端的带有正电荷的、能与核酸结合的三十多个氨基酸的HBcAg的截短体。HBc149在表达体系中能够自动组装成18或24面体的颗粒，免疫原性较好。[0005] 热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)具有独特的免疫学功能，其免疫学机制包括两方面。一是HSPs参与T细胞抗原呈递。热休克蛋白存在于细胞浆和内质网膜内，由多个成员组成：HSP60，HSP70，HSP90和gp96等。热休克蛋白作为分子伴侣在蛋白折叠与运输过程中发挥重要作用，能结合细胞中5-25mer的抗原多肽，通过抗原呈递细胞(APC)表面CD91分子进入细胞并将结合的抗原表位呈递给MHC I类和II类分子从而启动特异性T细胞免疫应。二是HSPs有效激发天然免疫。热休克蛋白本身是迄今为止发现的唯一的来源于哺乳动物细胞的天然佐剂，它可作用于APC及T细胞等其它免疫细胞，促进DC成熟，刺激细胞产生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，从而增强机体天然免疫反应。有研究表明，gp96对于APC中Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)发挥免疫学功能起至关重要的作用，gp96基因缺失的DC细胞中TLRs丧失引发天然免疫的功能，导致转基因小鼠抵抗感染的能力明显降低。

[0006] 由于组织来源有限，从组织提取的热休克蛋白gp96的产量有限，难以工业化应用，而且组织提取的gp96蛋白结合组织细胞内的抗原多肽，影响其与HBcAg和HBsAg的结合，从而影响疫苗的疗效。而采用汉逊酵母体外重组表达gp96蛋白，存在工程菌种中重组基因易丢失、表达量低下、蛋白不稳定和纯化难度大等一系列问题。

[0002]

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说 明 书

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开发一种稳定表达分泌型gp96蛋白的系统，对于制备以gp96蛋白作为佐剂的乙肝治疗性疫苗，具有重要意义。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供一种人热休克蛋白gp96的制备方法及其应用。[0009] 本发明提供一种制备人热休克蛋白gp96的方法，是在昆虫细胞中表达人热休克蛋白gp96；

[0010] 所述人热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。[0011] 上述方法中，所述在昆虫细胞中表达人热休克蛋白gp96的方法为将人热休克蛋白gp96的编码基因导入昆虫细胞中。[0012] 上述任一所述的方法中，所述人热休克蛋白gp96的编码基因是通过如下(1)或(2)所述的方法导入的：

[0013] (1)通过重组昆虫病毒表达载体导入所述昆虫细胞；[0014] (2)通过重组昆虫病毒导入所述昆虫细胞；

[0015] 所述重组昆虫病毒是通过所述重组昆虫病毒表达载体在昆虫细胞中表达或传代得到的；

[0016] 所述重组昆虫病毒表达载体导入所述昆虫细胞后，病毒组装形成并扩增，位于所述重组昆虫病毒表达载体上的人热休克蛋白gp96的编码基因随着病毒基因组的复制而复制，进而表达人热休克蛋白gp96；

[0017] 所述重组昆虫病毒表达载体在昆虫细胞中表达或传代的方法为如下1)或2)所示：

[0018] 1)将所述重组昆虫病毒表达载体导入昆虫细胞，得到转染的昆虫细胞，培养，离心收集上清，即得；

[0019] 2)将步骤1)得到的上清连续转接于昆虫细胞中进行扩大培养，离心收集上清，即得；

[0020] 所述扩大培养时，所述昆虫细胞为单层昆虫细胞或昆虫细胞悬浮液；[0021] 所述收集上清的时机具体为当细胞发生停止生长，病毒出芽，细胞不贴壁或细胞裂解时；

[0022] 所述导入的方法为所述(2)时，所述重组昆虫病毒与所述昆虫细胞的比例具体为(5-10)pfu：1个。

[0023] 上述任一所述的方法中，所述重组昆虫病毒表达载体为可在细菌和昆虫细胞之间转移和扩增的病毒穿梭质粒。

[0024] 上述任一所述的方法中，所述病毒穿梭质粒为杆状病毒穿梭质粒；

[0025] 所述杆状病毒穿梭质粒是将人热休克蛋白gp96的编码基因或SEQ ID No.3所示的DNA分子插入pFastBacTM 1质粒的EcoRI和XbaI酶切位点间，得到中间载体1；将中间载体1转化DH10BacTM E.coli，得到重组质粒，即得；

[0026]

所述pFastBacTM 1质粒和所述DH10BacTM E.coli均包含在

Baculovirus Expression System试剂盒中，该试剂盒购自Invitrogen，产品目录号为10359-016；

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说 明 书

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所述DH10BacTM E.coli中含有表达转座酶的helper质粒和可在细菌和昆虫细胞之间转移和扩增的杆状病毒穿梭质粒；

所述

Baculovirus Expression System试剂盒的操作原理如下：

首先将目的基因克隆到pFastBacTM 1载体上，得到中间载体1，然后将其转化DH10BacTM

[0028]

E.coli，利用DH10BacTM E.coli的helper质粒表达的转座酶将中间载体1上的目的基因插入杆状病毒穿梭质粒中，获得重组昆虫病毒表达载体，该重组昆虫病毒表达载体感染昆虫细胞表达目的蛋白；

TM

[0029] 所述昆虫细胞为Sf9细胞或High Five细胞。[0030] 上述任一所述的方法中，所述在昆虫细胞中表达人热休克蛋白gp96之后还包括将表达人热休克蛋白gp96的昆虫细胞培养液离心收集上清、过滤的步骤；[0031] 所述过滤具体为0.22mm滤膜过滤。[0032] 上述任一所述的方法中，所述过滤后还包括将滤液进行离子交换层析和分子筛层析的步骤；

[0033] 所述离子交换层析具体为HiTrap-Q Sepharose离子交换层析；[0034] 所述分子筛层析具体为Superdex 200 10/300 GL分子筛层析；[0035] 所述HiTrap-Q Sepharose离子交换层析的具体步骤如下：[0036] (a)将所述过滤得到的滤液上样HiTrap-Q Sepharose层析柱，流速为1ml/min；[0037] (b)用含有200mM NaCl的pH7.5的PBS洗脱缓冲液洗脱步骤(a)的层析柱，流速为1ml/min，洗去非特异性结合的蛋白；

[0038] (c)用含有300mM NaCl的pH7.5的PBS洗脱缓冲液洗脱步骤(b)的层析柱，流速为1ml/min，洗去杂蛋白；

[0039] (d)用含有600mM NaCl的pH7.5的PBS洗脱缓冲液洗脱步骤(c)的层析柱，流速为1ml/min，收集洗脱液，将其命名为洗脱液1；[0040] 所述滤液的上样体积具体为800ml；

[0041] 所述步骤(b)和(c)中的洗脱体积为5个柱体积以上；[0042] 所述Superdex 20010/300GL分子筛层析的具体步骤如下：[0043] (e)将洗脱液1上样Superdex 200 10/300 GL层析柱，流速为0.25ml/min；[0044] (f)用pH7.5的PBS缓冲液洗脱步骤(e)的层析柱，流速为0.25ml/min，用280nm进行检测，收集含有分子量为100-130KDa的蛋白的洗脱峰，即为所述人热休克蛋白gp96；[0045] 所述洗脱液1上样所述分子筛层析之前还含有将其浓缩的步骤；[0046] 所述浓缩具体是用PBS溶液进行浓缩；[0047] 所述洗脱液1的上样体积具体为1ml。

[0048] 由上述任一所述的方法制备得到的人热休克蛋白gp96也属于本发明的保护范围。

[0049] 一种疫苗也属于本发明的保护范围，该疫苗含有所述的人热休克蛋白gp96；[0050] 或，

[0051] 一种疫苗也属于本发明的保护范围，该疫苗含有免疫佐剂和免疫原，免疫佐剂为权所述的人热休克蛋白gp96，免疫原为HBc149和/或HBsAg；[0052] 所述疫苗中所述的人热休克蛋白gp96、HBsAg、HBc149的质量比具体为1：

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说 明 书

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(0.5-10)：(0.5-10)，再具体为1:5:5。

[0053] 上述人热休克蛋白gp96在制备免疫佐剂中的应用也属于本发明的保护范围；[00] 上述人热休克蛋白gp96在制备疫苗中的应用也属于本发明的保护范围；[0055] 所述疫苗具体为乙肝疫苗；

[0056] 所述乙肝疫苗具体为乙肝治疗性疫苗；

[0057] 所述乙肝治疗性疫苗的免疫原含有HBc149和HBsAg；

[0058] 所述乙肝治疗性疫苗中权利要求9所述的人热休克蛋白gp96、HBsAg、HBc149的质量比为1：(0.5-10)：(0.5-10)，具体为1:5:5；

[0059] 所述HBc149的编码基因序列如SEQ ID No.7中自5’末端起第12位至第458位核苷酸所示，HBc149的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

[0060] 上述人热休克蛋白gp96在制备预防和/或治疗乙肝病毒引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。[0061] 本发明的有益效果在于：[0062] 1、本发明采用昆虫细胞表达系统表达分泌型的人热休克蛋白gp96，该表达系统稳定，并且人热休克蛋白gp96的表达量高；[0063] 2、由本发明提供的昆虫细胞表达系统表达的人热休克蛋白gp96的糖基化更接近于哺乳动物细胞,蛋白稳定,且该蛋白是从细胞上清中提取，纯化过程简单；[00] 3、由本发明提供的昆虫细胞表达系统表达的人热休克蛋白gp96不结合昆虫细胞内的抗原多肽，因此可以更好的与HBcAg和HBsAg的结合，从而增强了其免疫学功能。由此昆虫细胞分泌表达的人热休克蛋白gp96作为佐剂研制的乙肝治疗性疫苗，可大幅提高乙肝治疗性疫苗的抗病毒疗效。

附图说明

[0065] 图1为昆虫细胞表达系统表达的分泌型人热休克蛋白gp96的SDS-PAGE鉴定结果。

[0066] 图2为大肠杆菌表达的HBc149蛋白的洗脱曲线及SDS-PAGE鉴定结果。

[0067] 图3为免疫后HBV转基因小鼠脾脏淋巴细胞中HBsAg和HBc149特异性T细胞的ELISPOT检测结果。

[0068] 图4为免疫后HBV转基因小鼠脾脏淋巴细胞内IFN-γ染色检测结果。[0069] 图5为免疫后HBV转基因小鼠血清中抗HBsAg抗体的ELISA检测结果。[0070] 图6为免疫后HBV转基因小鼠血清中抗HBcAg抗体的ELISA检测结果。[0071] 图7为免疫后HBV转基因小鼠血清中HBsAg的ELISA检测结果。[0072] 图8为免疫后HBV转基因小鼠血清中ALT测定结果。

[0073] 图9为免疫后HBV转基因小鼠血清中HBV DNA拷贝数的检测结果。

[0074] 图10为免疫后HBV转基因小鼠肝脏组织中表达HBcAg的肝细胞的比例。具体实施方式

[0075] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0076] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

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说 明 书

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下述实施例中的定量实验均设置三次重复，结果取平均值。[0078] 人肝癌细胞HepG2购自ATCC，产品目录号为HB-8065。

[0079] 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞购自Invitrogen公司，产品目录号为11496-015。

TM

[0080] High Five细胞购自Invitrogen公司，产品目录号为B855-02。

[0081]

Baculovirus Expression System购自Invitrogen，产品目录号

为10359-016，该试剂盒含有pFastBacTM 1质粒和DH10BacTM E.coli，DH10BacTM E.coli中含有表达转座酶的helper质粒和可在细菌和昆虫细胞之间转移和扩增的杆状病毒穿梭质粒。

Baculovirus Expression System试剂盒的操作原理如下：首先将目的

基因克隆到pFastBacTM 1载体上，得到中间载体1，然后将其转化DH10BacTM E.coli，利用DH10BacTM E.coli的helper质粒表达的转座酶将中间载体1上的目的基因插入杆状病毒穿梭质粒中，获得重组昆虫病毒表达载体，该重组昆虫病毒表达载体可以感染昆虫细胞表达目的蛋白。

TM

[0082] Insect-XPRESS Protein-free Insect Cell Medium with L-glutamine为昆虫细胞培养基，购自Lonza公司，货号为12-730Q。

[0083] HiTrap-Q Sepharose购自GE healthcare Life Sciences公司，产品目录号为17-1153-01。

[0084] Superdex 20010/300GL购自GE healthcare Life Sciences公司，产品目录号为17-5175-01。

[0085] pET21a(+)质粒购自Novagen公司，产品目录号为69710-3。

[0086] 大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为CB105-02。

[0087] 2×YT培养基按照如下方法制备：胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，加水溶解并定容至1000mL。[0088] pHBV质粒在文献“Fan H,Yan X,Zhang Y,Zhang X,Gao Y,Xu Y,Wang F,Meng S.Increased expression of Gp96by HBx-induced NF-κB activation feedback enhances hepatitis B virus production.PLoS One.2013Jun 11；8(6):e65588.；Zhang Y,Ren Y,Wu Y,Zhao B,Qiu L,Li X,Xu D,Liu J,Gao GF,Meng S.The L60V variation in hepatitis B virus core protein elicits new epitope-specific cytotoxic T lymphocytes and enhances viral replication.J Virol.2013Jul；87(14):8075-84.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。HiPrep 16/60Sephacryl S-400HR购自GE healthcare Life Sciences公司，产品目录号为28-9356-04。

[0090] pHFMDZ-R1A购自Invitrogen公司，产品目录号为V20520。[0091] 汉逊酵母购自ATCC，产品目录号为MYA-335。

[0092] SD液体培养基购自上海杰美基因医药科技有限公司，产品目录号为GMS12117.7。[0093] SYN6培养基购自上海杰美基因医药科技有限公司，产品目录号为GMS12116.1。[0094] BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。[0095] HBsAg购自北京天坛生物制品股份有限公司，批准文号：国药准字S10980007。

[00]

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说 明 书

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HBV转基因小鼠购自中国人民第四五八医院全军肝病中心。[0097] ELISPOT检测试剂盒购自深圳市达科为生物技术有限公司，产品目录号为DKW22-2000-096。

[0098] Mouse IFN-γELISPOT PLUS kit(HRP)购自Mabtech公司，货号为3321-2HW-Plus。

TM

[0099] BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit购自BD，货号为5715。

[0100] HRP标记的IgG抗体、HRP标记的IgG1抗体、HRP标记的IgG2a抗体均购自SEROTEC公司，产品目录号分别为STAR117P、STAR132P、STAR133P。[0101] TMB显色液购自碧云天生物技术研究所，产品目录号为P0209。

[0102] 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司，批准文号：国药准字S10910113。

[0103] 丙氨酸转氨酶检测试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司，产品目录号为6129B。[0104] 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，产品目录号为#DA-B051。

[0105] 抗HBcAg抗体购自santa cruz，产品目录号为sc-52407。实施例1、昆虫杆状病毒表达系统表达人热休克蛋白gp96[0107] 一、Bacmid-gp96质粒的构建[0108] (一)gp96引物的设计与合成[0109] 设计并合成如下引物：[0110] 正向引物：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGATGT-3’(SEQ ID No.1)[0111] (下划线所示序列为EcoRI酶切识别位点)[0112] 反向引物：5-GCTCTAGATTACAATTCATCTTTTTCAGCTG-3’(SEQ ID No.2)[0113] (下划线所示序列为XbaI酶切识别位点)

[0114] (二)提取人肝癌细胞HepG2的mRNA,并反转录合成cDNA。[0115] (三)以步骤(二)的cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如SEQ ID No.3所示。[0116] SEQ ID No.3中自5’末端起第8位至第2356位为人热休克蛋白gp96的编码基因，人热休克蛋白gp96的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0117] (四)EcoRI和XbaI双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子，得到基因片段；EcoRI和XbaI双酶切pFastBacTM 1质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒1，将其命名为pFastBac-gp96，将pFastBac-gp96送测序，结果正确。

[0106] [0118]

(五)按照Baculovirus Expression System说明书进行操作，

将pFastBac-gp96转化DH10BacTM E.coli，获得重组质粒2，将其命名为Bacmid-gp96，将Bacmid-gp96测序，结果正确。[0119] 二、昆虫细胞表达人热休克蛋白gp96及纯化过程

[0120]

(一)按照Baculovirus Expression System说明书进行操作，利用

Cellfectin II reagent将Bacmid-gp96转染Sf9细胞：在六孔板加入2mlInsect-XPRESSTM Protein-free Insect Cell Medium with L-glutamine培养的数量为1×106的Sf9细胞，置于室温，将4ug的Bacmid-gp96加入100ul转染培养基中，将8ulCellfectin II reagent

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说 明 书

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加入100ul转染培养基中，二者室温静置5分钟后混匀，得到混合液，室温避光静置20min，用2ml转染培养基将六孔板中的细胞洗涤一次，去掉培养基，在装有混合液的Ep管中加入800ul转染培养基，充分混匀后再将其加入到六孔板中与细胞混匀，再将细胞置于27℃培养5小时后，将培养基换为Insect-XPRESSTM Protein-free Insect Cell Medium with L-glutamine。

(二)将细胞置于27℃培养3-7天，直到出现病变。细胞病变早期现象为细胞直

径增大，细胞核变大；病变晚期表现为细胞停止生长，病毒出芽，细胞不贴壁；病变晚期细胞裂解。在细胞出现病变晚期特征后，将细胞和包含病毒的培养液500g离心5min，去除细胞和细胞碎片，获得的上清液即为重组杆状病毒P1样品，将其置于4℃避光保存。重组杆状病毒P1样品可以用来生成滴度更高的重组杆状病毒P2、P3、P4样品，也可以直接用于蛋白表达。

[0122] 其中重组杆状病毒P2、P3、P4样品的制备方法如下：

[0121] [0123] [0124]

按照Baculovirus Expression System说明书提供的公式：

X ml(需要病毒量)＝[MOI(pfu/细胞)×细胞数目]/病毒滴度(pfu/细胞)[0125] 其中MOI(multiplicity of infection)称为感染复数，单位为每个细胞感染的病毒颗粒数，一般扩增病毒MOI的值选择0.05-0.1。细胞数目为待接种病毒的细胞的数目。

77

[0126] 将1ml滴度为1×10pfu/ml的P1毒加到10ml浓度为1×10个细胞/mL的Sf9单层细胞中，27℃，120rpm，用Insect-XPRESSTM Protein-free Insect Cell Medium with L-glutamine培养72h，同样在细胞出现病变晚期特征后，将细胞和包含病毒的培养液4000rpm离心5min，去除细胞和细胞碎片，收取上清获得二代毒，即为重组杆状病毒P2样品。

[0127] 将重组杆状病毒P2样品按照上述同样的制备方法可获得更高滴度，更大体积的重组杆状病毒P3、P4样品。

[0128] (三)将重组杆状病毒P1、P2、P3或P4样品用Grp96(购自Santa Cruz)作为一抗进行western blotting杂交，结果表明人热休克蛋白gp96已经在Sf9细胞中表达。

TM

[0129] (四)在Insect-XPRESS Protein-free Insect Cell Medium with L-glutamine中培养High FiveTM细胞，当High FiveTM细胞密度达到2×106个细胞/mL时，取600ml细胞培养液，按照MOI＝5加入滴度为4×107pfu/ml的P1、P2、P3或P4样品150ml(病毒：细胞＝(5-10)pfu：1个均可)，27℃,120rpm，悬浮培养72小时，得到培养液，然后将其7000rpm离心20min，得到上清液，该上清液含有人热休克蛋白gp96。(五)将步骤(四)得到的上清液经过0.22mm滤膜滤过后，得到滤液，再将滤液进行如下HiTrap-Q Sepharose离子交换层析和Superdex 200 10/300 GL分子筛层析以得到较纯的人热休克蛋白gp96。

[0131] (1)HiTrap-Q Sepharose离子交换层析[0132] (a)将滤液800ml上样于层析柱，流速为1ml/min；

[0133] (b)用至少5个柱体积(具体为5ml)含有200mM NaCl的pH7.5的PBS洗涤步骤(a)的层析柱，流速为1ml/min，洗去非特异性结合的蛋白；

[0134] (c)用至少5个柱体积(具体为10ml)含有300mM NaCl的pH7.5的PBS洗涤步骤(b)的层析柱，流速为1ml/min，洗去杂蛋白；

[0130]

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(d)用3ml含有600mM NaCl的pH7.5的PBS洗涤步骤(c)的层析柱，流速为1ml/min，得到的洗脱液，将该洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，结果如图1的泳道1所示，结果表明该洗脱液含有分子量在100-130KDa的人热休克蛋白gp96。[0136] (2)Superdex 200 10/300 GL分子筛层析

[0137] (a)将HiTrap-Q Sepharose离子交换层析步骤(d)所得的洗脱液通过50Kd超滤管(购自Merck Millipore,货号为UFC905096)浓缩换液，用PBS溶液浓缩为1ml，得到浓缩液；

[0138] (b)通过上样环将浓缩液上样于层析柱，流速为0.25ml/min；[0139] (c)用pH7.5的PBS缓冲液洗涤柱子，流速为0.25ml/min，用280nm进行检测，收集洗脱峰，并将洗脱峰进行SDS-PAGE鉴定，其中9-12ml处洗脱峰的SDS-PAGE鉴定结果如图1的泳道2所示，结果表明该洗脱峰含有分子量在100-130KDa的人热休克蛋白gp96。该洗脱峰即为具有较高纯度的人热休克蛋白gp96。

[0140] (六)将图1所示的电泳凝胶用Grp96(购自Santa Cruz)作为一抗进行western blotting杂交，发现上述分子量在100-130KDa的蛋白具有杂交条带，进一步确定该条带为人热休克蛋白gp96。

将上述步骤(五)中(c)收集的9-12ml处洗脱峰(即较高纯度的人热休克蛋白

gp96)用50Kd超滤管浓缩，采用BCA法测定蛋白浓度，最后将蛋白分装，贮存于-80℃。[0142] 实施例2、HBc149抗原的制备[0143] 一、pET21a-HBc149质粒的构建[0144] (一)HBc149引物的设计与合成[0145] 设计并合成如下引物：[0146] HBC149up primer:5’-GGGAATTCcatatgGACATTGACCCGTATAAAGAATTTG-3’(SEQ ID No.5)

[0147] (下划线所示序列为Nde I酶切识别位点)[0148] HBC149down primer:5’-CCGctcgagTCAAACAACAGTAGTTTCCGGAAGT-3’(SEQ ID No.6)

[0149] (下划线所示序列为XhoⅠ酶切识别位点)[0150] (二)以pHBV质粒为模板，以HBC149 up primer和HBC149down primer为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如SEQ ID No.7所示。[0151] SEQ ID No.7中自5’末端起第12位至第458位为HBc149的编码基因，HBc149的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

[0152] (三)Nde I和XhoⅠ双酶切SEQ ID No.7所示的DNA分子，得到基因片段；Nde I和Xho Ⅰ双酶切pET21a(+)质粒，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET21a-HBc149，将pET21a-HBc149送测序，结果正确。[0153] 二、原核表达HBc149病毒核心颗粒抗原[01] 利用大肠杆菌表达HBc149抗原，具体方法如下：

[0141]

(一)将pET21a-HBc149转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，从平板上挑取单菌落接入含100mg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基活化12h，得到活化液，再将10ml活化液接入1L 2×YT培养基中，37℃培养至OD600值为0.6-1.0，然后加入终浓度为1mmol/L的

[0155]

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IPTG，37℃诱导5h，收集菌体。

[0156] (二)将菌体用80ml含有5mM DTT、1mM PMSF,0.01mg/mL DNase I、0.1mg/mLRNase A的pH 7.5的50mM Tris-HCl缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎(200W，破碎3s停7s，99次3个循环)，然后4℃12000rpm离心20min，收集上清。

[0157] (三)向上清中缓慢加入固体硫酸铵至40％饱和度(使得固体硫酸铵的终浓度为22.6g/100ml)，4℃缓慢搅拌1h，然后4℃,12000转/min离心20min，弃上清，收集沉淀。[0158] (四)用50ml含有100mM NaCl,2mM DTT的pH 7.5的100mM Tris-HCl缓冲液重悬重悬步骤(三)得到的沉淀，4℃12000rpm离心20min，得上清，将上清转移至50KD超滤浓缩管浓缩，得到蛋白浓缩液。

[0159] (五)再将蛋白浓缩液经HiPrep 16/60Sephacryl S-400HR分子筛分离纯化，在50-68ml处收集蛋白即为HBc149多聚体(约2700-3600kD)起峰处收集蛋白，蛋白经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。[0160] 具体如下：用ddH2O平衡一个柱体积(120ml)，然后用含有100mM NaCl,2mM DTT的pH 7.5的100mM Tris-HCl缓冲液平衡一个柱体积(120ml)，待5ml上样环用ddH2O及含有100mM NaCl,2mM DTT的pH 7.5的100mM TRIS-HCL缓冲液平衡好后，将蛋白浓缩液经4℃12000rpm离心10min后，取上清上样，用含有100mM NaCl,2mM DTT的pH 7.5的100mM TRIS-HCL缓冲液洗脱，以280nm为检测波长，收集洗脱峰，并进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，洗脱曲线以及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果如图2A所示。图2A中，洗脱曲线中的洗脱峰1、2分别对应于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的泳道1、2的样品。图2A表明，洗脱峰2含有目的蛋白的单体(如箭头所示)，目的蛋白是HBc149多聚体(约2700-3600kD)，洗脱峰2为50-68ml处收集的洗脱液。

[0161] (六)将步骤(五)收集的蛋白洗脱峰2用10mM Tris-HCl(pH 7.5)换液后，得到换液后的蛋白，经HiTrap-Q Sepharose离子交换层进一步纯化，收集穿透，蛋白经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。[0162] 具体如下：先用A液(pH 7.5的10mM Tris-HCl缓冲液)和B液(含有1M NaCl的pH 7.5的10mM Tris-HCl缓冲液)交替2-3次平衡柱子，在A液充满柱子的时候，将换液后的蛋白上柱，用A液(pH 7.5的10mM Tris-HCl缓冲液)洗脱，以280nm为检测波长，收集穿透液，并进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2B所示，目的蛋白的单体如图2B中的箭头所示。

[0163] (七)将上述收集的穿透用PBS缓冲液换液，浓缩，即为HBc149蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。[01] 三、利用TritonX-114萃取法去除内毒素

[0165] 取步骤二制备的HBc149蛋白加入Triton X-114(使得Triton X-114的体积百分含量为1％)，4℃混匀30min，置于37℃水浴中10min，4℃20000g离心10min，取上清，该上清含有HBc149蛋白；重复上述步骤两次，得到去除内毒素的HBc149(内毒素去除率达到99％)。[0166] 采用鲎试剂法检测去除内毒素的HBc149中的内毒素含量(具体可参考文献“唐宝璋，燕奎华，黄礼云，庄林，游晶，陈红英.慢性乙型肝炎患者血清内毒素、IL-4、IL-18水平的变化.世界华人消化杂志,2003,11(12)：2041-2.”)，测得去除内毒素的HBc149中的内毒素浓度低于10EU/mg。

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实施例3、汉逊酵母表达的人热休克蛋白gp96(Y-gp96)的制备[0168] 可参考文献“Li Y,Song H,Li J,Wang Y,Yan X,Zhao B,Zhang X,Wang S,Chen L,Qiu B,Meng S.Hansenula polymorpha expressed heat shock protein gp96exerts potent T cell activation activity as an adjuvant.J Biotechnol.20；151(4):343-9.”公开的方法制备汉逊酵母表达的人热休克蛋白gp96(Y-gp96)。[0169] 一、pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96质粒的构建

[0170] (一)提取人肝癌细胞HepG2的mRNA,并反转录合成cDNA。[0171] (二)以步骤(一)的cDNA为模板，以上游引物1和下游引物1为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0172] 上游引物1：5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3'；(SEQ ID No.9)[0173] (下划线所示序列为EcoRI酶切识别位点)[0174] 下游引物1：5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3'。(SEQ ID No.10)[0175] (下划线所示序列为XhoI酶切识别位点)[0176] (三)用EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pHFMDZ-R1-gp96。将pHFMDZ-R1-gp96测序，测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了gp96蛋白的编码基因序列，即SEQ ID No.3中自5’末端起第8位至第2356位所示的核苷酸序列。[0177] (四)在pHFMDZ-R1-gp96的BglII酶切位点插入LEU2片段，BamHI酶切位点插入α-淀粉酶报告系统，得到重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96，将pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96送测序，结果正确。[0178] 二、汉逊酵母表达gp96蛋白(Y-gp96)

[0179] (一)采用电转化法将重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96导入汉逊酵母细胞，得到重组菌。

[0180] (二)将重组菌接种于5mL SD液体培养基，37℃培养48h，然后再转接到100mL SYN6培养基,30℃培养48h，得到种子培养液。

[0181] (三)将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养；使用氨水控制pH维持在5.5；每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5％左右，同时控制溶氧在20％以上；根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导Y-gp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8％左右)，诱导开始72小时后停止发酵。[0182] 三、Y-gp96蛋白的分离纯化

[0183] 将步骤二的发酵液离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILL model KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞；破碎后的细胞12000rpm离心20min，收集上清液；上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液，将滤液进行浓缩，得到浓缩液。将浓缩液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的Ni-NTA Purification System进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h；然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h；将浓缩液用PBS(含20mM咪唑)稀释后

[0184]

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上样；用PBS(含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值<0.01；用PBS(含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液(即为Y-gp96蛋白)；所有操作在4℃下进行，流速为0.5mL/min。

[0185] 每升步骤二的发酵液纯化后可以获得50mg纯度90％以上的Y-gp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液进行离子交换层析(Q柱)，主要步骤：200mM NaCl的PBS液平衡；上样；300mM NaCl的PBS液洗杂质；800mM NaCl的PBS液洗目的蛋白。

实施例4、天然gp96提取物(L-gp96)的制备[0187] 用小鼠肝脏制备gp96提取物(L-gp96)，具体方法如下：[0188] 一、组织匀浆

[01] 匀浆缓冲液配方：在pH7.0的碳酸氢钠缓冲液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式为C7H7FO2S)至终浓度1mM(置于冰上的烧杯中配置；PMSF在水溶液中数小时内分解，该溶液不可过夜)。

[0190] 取烧杯置于冰上，将BALB/c小鼠肝组织在烧杯中迅速用剪刀剪成直径约1-2毫米的碎块，然后加入组织8倍重量的匀浆缓冲液；将组织碎块搅匀倒入玻璃匀浆器，匀浆至底部组织块消失后再上下匀浆15次以上；匀浆液倒入离心管，50,000g离心60min,取上清加入1/10体积的10×PBS(pH7.5，含有200mM NaCl)，用于下述的ConA-Sepharose层析。[0191] 二、ConA-Sepharose层析

[0192] 载体为ConA-Sepharose(购自GE公司，产品号17-0440-01)，按“1ml载体/4g组织”计算使用量。层析柱的内径和柱长是1.6×2.5cm。[0193] 将上清用蠕动泵上样，0.25ml/min。在PBS(pH7.5，含有200mM NaCl)中加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液甲；用蠕动泵将10倍柱体积的洗脱液甲过层析柱(0.5ml/min)，以去除未结合蛋白。在PBS(pH7.5，含有200mM NaCl)中加α-D-吡喃葡萄糖至终浓度10％(10g/mL),加PMSF至终浓度1mM，作为洗脱液乙；用蠕动泵将3倍柱体积的洗脱液乙过层析柱(0.25ml/min)，收集洗脱液。[0194] 三、HiTrap-Q Sepharose离子交换层析

[0195] 载体为HiTrap-Q Sepharose(层析柱为HiTrap Q HP；购自GE公司，产品号17-1153-01)。层析柱的内径和柱长是0.7×2.5cm。[0196] 将载体装柱后，先用5ml PBS(pH7.5，含有200mM NaCl)清洗(1ml/min)。将步骤二的洗脱液上样(1ml/min)；然后将5ml PBS(pH7.5，含有200mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，以去除未结合蛋白；然后将10ml PBS(pH7.5，含有300mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，以去除未结合蛋白；然后将3ml PBS(pH7.5，含有600mM NaCl)过层析柱(1ml/min)，收集洗脱液，即为gp96提取物(L-gp96)。

[0186]

实施例5、乙肝治疗性疫苗的制备和效果评价

[0198] 实施例中用于蛋白免疫的HBc149是实施例2中制备得到的去除内毒素的HBc149蛋白，I-gp96为实施例1中昆虫杆状病毒表达系统表达的人热休克蛋白gp96，Y-gp96是实施例3中汉逊酵母表达的人热休克蛋白gp96，L-gp96为实施例4中从小鼠肝脏组织中提取的天然gp96蛋白。[0199] 一、分组给药

[0200] 对HBV转基因小鼠进行随机分组，每组10只，分别进行如下免疫：

[0197]

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第一组(PBS组)：第1次免疫、第2次免疫和第3次免疫均为免疫pH7.5的PBS缓

冲液。

第二组(HBc149+HBsAg组)：第1次免疫、第2次免疫和第3次免疫均为免疫HBc149(100微克/只)和HBsAg(100微克/只)。[0203] 第三组(Y-gp96组)：第1次免疫、第2次免疫和第3次免疫均为免疫HBc149(100

[0202]

微克/只)、HBsAg(100微克/只)和Y-gp96(20微克/只)。[0204] 第四组(L-gp96组)：第1次免疫、第2次免疫和第3次免疫均为免疫HBc149(100微克/只)、HBsAg(100微克/只)和L-gp96(20微克/只)。[0205] 第五组(I-gp96组)：第1次免疫、第2次免疫和第3次免疫均为免疫HBc149(100微克/只)、HBsAg(100微克/只)和I-gp96(20微克/只)。[0206] 上述各组中，HBc149、HBsAg是作为免疫原，Y-gp96蛋白、L-gp96蛋白和I-gp96蛋白是作为免疫佐剂。

[0207] 进行上述各组的免疫前，将第二、三、四、五组用于免疫的蛋白在组装体系中进行组装，制成免疫试剂。组装体系的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 8g/L,KCl0.2g/L,KH2PO4 0.24g/L,Na2HPO4·12H2O 3.63g/L,；组装条件：4℃30-120分钟。各组的每次免疫试剂的剂量均为200ul/小鼠，免疫方式均为皮下注射，第一次免疫时间为实验开始第一周、第二次免疫时间为实验第三周、第三次免疫时间为实验第四周，各组的免疫时间均一致。

[0208] 二、免疫相关因子的分析

[0209] (一)免疫开始后的第8周时，取各组小鼠的脾细胞采用ELISPOT检测试剂盒和Mouse IFN-γELISPOT PLUS kit(HRP)试剂盒进行ELISPOT分析，结果如图3所示。[0210] 图3表明，PBS组和HBc149+HBsAg组只有很弱的HBcAg和HBsAg特异性的T细胞反应，与PBS组和HBc149+HBsAg组相比，Y-gp96、L-gp96和I-gp96组均能引起很强的HBcAg和HBsAg特异性的T细胞反应，并且I-gp96蛋白作为佐剂的免疫试剂激活的T细胞反应显著强于Y-gp96和L-gp96介导的T细胞反应，说明I-gp96蛋白的免疫佐剂活性更高。[0211] (二)免疫开始后的第8周时，取各组小鼠的脾脏淋巴细胞，采用BDCytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Solution Kit进行IFN-γ细胞内细胞因子染色，结果如图4所示。[0212] 图4表明，与PBS和HBc149+HBsAg组相比，Y-gp96、L-gp96和I-gp96组CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力显著增强，并且I-gp96组CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力显著地高于Y-gp96和L-gp96组，进一步说明I-gp96免疫佐剂活性更高。(三)免疫开始后的第8周时，取各组小鼠的血清进行ELISA检测，具体操作如下：[0214] 1、在ELISA板上每孔包被10ug HBsAg(或HBc149)，4℃孵育过夜；[0215] 2、以TBS-T清洗3遍，每遍清洗5min；[0216] 3、将各组小鼠的血清分别用pH7.5的PBS稀释，每孔加入100ul，每个小鼠的血清重复3个孔，分别用于检测IgG、IgG1、IgG2a，37℃孵育2h；[0217] 4、以TBS-T清洗3遍，每遍清洗5min；[0218] 5、在重复的3个孔中分别加入HRP标记的IgG抗体、HRP标记的IgG1抗体、HRP标记的IgG2a抗体，37℃孵育1h；

[0213]

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6、以TBS-T清洗3遍，每遍清洗5min；[0220] 7、每孔加入100ulTMB显色液，37℃放置15min后加入50ul 2M硫酸终止反应；[0221] 8、将ELISA板在酶标仪上以波长490nm检测。[0222] 包被HBsAg的ELISA检测结果如图5所示。[0223] 包被HBc149的ELISA检测结果如图6所示。[0224] 图5和图6表明，与PBS和HBc149+HBsAg组相比，Y-gp96、L-gp96和I-gp96组的IgG、IgG1抗体、IgG2a的水平显著增加，表明体液免疫水平显著提高。[0225] 以上实验通过检测Y-gp96、L-gp96和I-gp96组特异性T细胞反应和体液免疫水平，证明I-gp96免疫佐剂活性更高。[0226] 三、疫苗效果评价[0227] 自第一次免疫开始，每周检测一次各组小鼠血清中HBsAg和丙氨酸转氨酶水平,第8周时检测各组小鼠血清中HBV DNA拷贝数和小鼠肝脏中的HBcAg水平。[0228] (一)检测血清中的HBsAg水平

[0229] 各组小鼠血清中HBsAg采用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)检测，操作步骤按照试剂盒说明书进行。检测结果如图7所示。[0231] 图7表明，与PBS组和HBc149+HBsAg组相比，Y-gp96、L-gp96和I-gp96组HBsAg在第2周开始下降。gp96作为佐剂能显著地增强疫苗的抗病毒能力,第8周时,各处理组之间小鼠血清中乙肝表面抗原(HBsAg)水平对比如下，Y-gp96v.s.HBc149+HBsAg＝0.83±0.101v.s.1.37±0.086，P<0.01；L-gp96v.s.HBc149+HBsAg＝0.±0.140v.s.1.37±0.086，P<0.01；I-gp96v.s.HBc149+HBsAg＝0.43±0.050v.s.1.37±0.086，P<0.01。

[0232] 以酵母菌、昆虫细胞分泌表达或天然提取的gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗免疫小鼠之间血清乙肝表面抗原(HBsAg)水平对比如下，Y-gp96v.s.I-gp96＝0.83±0.101v.s.0.43±0.050,P<0.05；L-gp96v.s.I-gp96＝0.±0.140v.s.0.43±0.050,P<0.05。可见I-gp96组HBsAg的水平分别比Y-gp96组和L-gp96组低约48％和52％(P<0.01)，说明以I-gp96为佐剂的疫苗抗HBV能力显著高于以Y-gp96或L-gp96作为佐剂的疫苗抗HBV能力。

[0233] (二)检测血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)水平

[0234] 采用丙氨酸转氨酶检测试剂盒检测各组小鼠血清中的ALT水平，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

[0235] 结果如图8所示。[0236] 图8表明，Y-gp96、L-gp96和I-gp96组的血清ALT水平在第3周时开始升高，第5周达到峰值，到第8周时回复到正常水平，PBS组和HBc149+HBsAg组血清ALT水平保持稳定。

[0237] 第8周时，PBS组的ALT水平为24U/L，HBc149+HBsAg组的ALT水平为20U/L，Y-gp96的ALT水平为25U/L，L-gp96的ALT水平为20U/L，I-gp96组的ALT水平为24U/L。

[0230]

血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)水平升高表明疫苗能够激活病毒特异性的T细胞反应且不引起严重的肝损伤。

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说 明 书

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(三)检测血清中的HBV DNA拷贝数

[0240] 使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对各组小鼠的100μl血清进行DNA拷贝数的绝对定量，操作步骤按照试剂盒说明书进行。[0241] 结果如图9所示。[0242] 第8周：PBS组的DNA水平为107.04个拷贝，HBc149+HBsAg组的DNA水平为106.22个拷贝，Y-gp96的DNA水平为103.68个拷贝，L-gp96的DNA水平为103.6个拷贝，I-gp96组的DNA水平为102.22个拷贝。[0243] 图9表明，与PBS组和HBc149+HBsAg组相比，Y-gp96、L-gp96和I-gp96组小鼠血清中HBV DNA拷贝数明显降低100倍以上。[0244] 以酵母菌、昆虫细胞分泌表达或天然提取的gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗免疫小鼠之间血清病毒DNA水平对比如下，Y-gp96v.s.I-gp96＝3.68±0.29v.s.2.22±0.29,P<0.05；L-gp96v.s.I-gp96＝3.6±0.40v.s.2.22±0.29,P<0.05。可见，I-gp96组HBV DNA拷贝数水平分别比Y-gp96组和L-gp96组约低28倍和23倍(P<0.05)，说明以I-gp96作为佐剂的疫苗抗HBV能力显著高于以Y-gp96或L-gp96作为佐剂的疫苗抗HBV能力。

(四)检测肝细胞的C抗原

[0246] 以抗HBcAg抗体对将各组小鼠的肝脏进行免疫组化分析，统计HBcAg阳性细胞在肝细胞中的比例，结果如图10所示。[0247] 图10表明，PBS组中HBcAg阳性细胞在肝细胞中的比例为74％，HBc149+HBsAg组的比例为62.6％，Y-gp96的比例为23.4％，L-gp96的比例为22.4％，I-gp96组的比例为7.2％。

[0248] 以酵母菌、昆虫细胞分泌表达或天然提取的gp96为佐剂的乙肝治疗性疫苗免疫小鼠之间HBcAg阳性细胞在肝细胞中的比例对比如下，Y-gp96v.s.I-gp96＝23.4±5.37v.s.7.2±2.49,P<0.05；L-gp96v.s.I-gp96＝22.4±5.13v.s.7.2±2.49,P<0.05。可见，I-gp96组HBcAg阳性细胞在肝细胞中的比例分别比Y-gp96组和L-gp96组约低69％和68％(P<0.05)，说明以I-gp96作为佐剂的疫苗抗HBV能力显著高于以Y-gp96或L-gp96作为佐剂的疫苗抗HBV能力。

[0249] 通过HBV转基因鼠验证，以昆虫杆状病毒表达系统表达的人热休克蛋白gp96(I-gp96)作为佐剂的乙肝治疗性疫苗的抗HBV活性显著地高于以汉逊酵母表达的人热休克蛋白gp96(Y-gp96)或天然gp96提取物(L-gp96)作为佐剂的乙肝治疗性疫苗的抗HBV活性。

[0250] 上述实验中，当第五组(I-gp96组)的免疫制剂中gp96、HBsAg、HBc149的质量比为1：(0.5-10)：(0.5-10)时均可以得到上述结论。

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图10

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