加热诱导结肠癌细胞Lovo凋亡的研究

　第18卷　第5期　2005年5月

医学研究生学报

JournalofMedicalPostgraduates

Vol.18　No.5

May.2005

・论　　著・加热诱导结肠癌细胞Lovo凋亡的研究

朱惠明,　王　娜,　黄　勋

(暨南大学医学院第二附属医院/深圳市人民医院消化内科,广东深圳518020)

摘要:　目的:观察加热对人结肠癌细胞株Lovo的凋亡作用。　方法:用Hochest33258荧光染色、凝胶电泳和流式

细胞术观察不同时间2温度作用下Lovo细胞的变化。　结果:不同温度2时间处理的细胞均发生凋亡,出现明显的形态学改变及凋亡特有的亚二倍体峰和DNA梯度。其中43℃处理3、4h和44℃处理1、2h时细胞凋亡最明显,细胞周期也发生变化。　结论:加热可诱导人结肠癌细胞株Lovo发生凋亡,并具有一定的周期特异性。关键词:　加热;　结肠癌细胞;　凋亡

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中图分类号:　R735.3　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　100828199(2005)0520399203

TheeffectsofhyperthermiaonapoptosisinhumancoloniccarcinomacelllineLovoZHUHui2ming,WANGNa,HUANGXun

(DepartmentofGastroenterology,AffiliatedShenzhenPeople’sHospital,MedicalCollegeofJinanUniver2sity,Shenzhen518020,Guangdong,China)

Abstract:　Objective:TostudytheeffectsofhyperthermiaonapoptosisinhumancoloniccacinomacelllineLovo.　Methods:Lovocellswereexposedtohyperthemiaandapoptosiswasmeasuredwithfluores2centHocehst33258staining,electropherogramgel,flowcytometry(FCM).　Results:Significantchan2gesincellmorphology,apoptosispeakapearedbeforetheG1phaseandDNAladderwasobservedinva2riousgroupcellswhichwereexposedtodifferenttemperatureandindifferenttime.Mostsignificentchan2geswereobservedincellsexposedto43℃for3,4hand44℃for1,2h.Alsocellcyclewasfoundchanged.　Conclusion:HyperthermiacancauseapoptosisinhumancoloniccacinomacelllineLovo,andhasphase2specificity.Keywords:　Hyperthermia;　Humancoloniccacinomacell;　Apoptosis0　引　言

　　结肠癌的治疗是临床工作的难题之一,人们一直在努力探索新的治疗方法。热疗作为一种肿瘤辅

[1]

助治疗手段正逐渐被广泛应用。本研究通过加热培养中的结肠癌细胞,研究不同温度对肿瘤细胞的作用,为结肠癌的热疗提供实验室依据。1　材料和方法

1.1　主要材料　人结肠癌细胞株Lovo购自中山医科大学细胞室。细胞培养用培养液为GIBICO产

收稿日期:　2004210218;　修订日期:　2004212203

品。Hochest33258染色试剂盒为碧云天公司产品。

碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品。隔水式恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司。1.2　方法1.2.1　试验分组　将培养的细胞按照试验要求分成41℃、42℃、43℃、44℃组和37℃组(对照组)共5组。每个温度组分成四个亚组,分别在不同温度孵育1、2、3、4h。每个亚组细胞分成5个平皿。分皿后细胞在37℃5%CO2孵箱中培养1～2天,使细胞生长至70%～80%汇合,将细胞置入不同温度的培养箱中分别作用1～4h。

3

作者简介:　朱惠明(19512),男,湖北武汉人,主任医师,医学博士,从事消化内科专业。

・400・医学研究生学报1.2.2　DNA染色观察细胞凋亡情况　根据Ho2

chest33258染色试剂盒操作要求进行。1.2.3　凝胶电泳观察细胞的凋亡情况　提取不同实验组细胞的基因组DNA,实验操作按照参考文献[2]进行。1.5%琼脂糖凝胶,35V50mA电泳4h,观察是否有DNA梯度出现。1.2.4　流式细胞仪分析细胞凋亡情况及细胞周期改变　收集不同处理组的细胞,PBS洗涤后,用70%的乙醇固定过夜(14h以上),RNAaseA(20g/L)37℃,30min,加入碘化丙啶(PI,50g/L)室温

避光15min,上机检测及分析。

1.3　统计学方法　结果以均数±标准差(x±s)表示。用方差分析比较相同处理时间下高温组与对照组的凋亡指数。以P≤0.05为差异有显著性意义。2　结　　果

2.1　显微镜观察　对照组细胞无明显形态学变化。

加热组细胞可见不同程度的缩小变圆、贴壁率降低和

细胞质“出泡”等细胞凋亡的形态学特征。44℃组3h后细胞多已大片脱落,死亡较多。Hochest33258染色后对照组可见均匀分布的蓝色荧光,而实验组细胞的蓝色荧光多成块状或碎片状分布,不同温度时间作用组均可见明显凋亡的DNA改变过程。并且随温度的升高和作用时间的延长,荧光成块状分布的细胞明显增多(图1～图3,插图一)。2.2　凝胶电泳观察细胞基因组DNA裂解情况　结果显示随着温度2时间的增加,细胞DNA裂解为均匀小片段并逐渐增多,形成的DNA梯度逐渐明显,见图4。

图4　DNA梯度凝胶电泳检测结果

Figure4　DNAladderafterelectropherogramgel　　　1、9:标记物;　2:对照组;　3～6:分别为43℃处理1、2、3、4h

后;　7、8:分别为44℃处理1、2h后

2.3　流式细胞术检测细胞凋亡情况　不同时间、不

同温度处理的细胞均存在细胞凋亡现象。其中43℃处理3、4h和44℃处理1、2h时,细胞凋亡最

2005年5月　第18卷　

明显。与37℃组相比差异有显著性意义(P<0.05)。从细胞周期看,加热处理后,细胞周期发生变化:G1期细胞下降,而S期和G2/M期细胞均上升,并可见凋亡特有的亚二倍体峰,见表1。

表1　不同温度和时间处理组细胞的凋亡率(x±

s,%)Table1　Differentapoptosisrateinvariousgroupcells

(x±s,%)组　别n1h2h3h4h37℃组50.7±0.30.8±0.31.0±0.21.0±0.441℃组53.5±0.73.3±0.63.8±0..1±0.342℃组55.2±0.46.1±0.86.5±0.27.8±0.3℃组56.5±0.78.2±0.5.1±1.58323.2±1.3344℃组518.4±0.6326.1±1.23155.3±0.57.4±0.8　　与37℃组相比,3P<0.053　讨　　论

　　肿瘤的增生取决于两个主要因素,即细胞的增

殖和凋亡引起的细胞死亡[3]

。细胞凋亡机制的减弱或障碍可导致肿瘤的发生;同样,通过诱导细胞凋亡也可对肿瘤的消除起到一定的积极作用。近年来的研究表明,加热可诱导一些种类的肿瘤细胞凋亡[4]

,其触发机制可能与热休克蛋白的表达有关[5]

,但不同类型的肿瘤细胞对加热诱导凋亡的反

应差别很大[6]

。因此,有必要了解不同肿瘤细胞对加热的敏感程度,以提高热疗的疗效。　　本研究发现,在不同温度和时间作用下,加热均能诱导肿瘤细胞凋亡,对于人结肠腺癌细胞Lovo来说,43℃处理3、4h和44℃处理1、2h为引发凋亡的最佳条件。延长处理时间以及升高处理温度均不能使凋亡率上升或反而有所下降。这可能是与长时间加热处理使肿瘤细胞以坏死为主有关。但在实际治疗中,不可能无限度地升高温度和延长时间。流式细胞技术和DNA梯度分析也证实了这一结果。在细胞核内,DNA与组蛋白核心结合形成核小体,然后凝集螺旋成染色体。在细胞凋亡后期,活化的核酸酶以核小体为单位剪切染色体,形成许多长度为200bp倍数的DNA片段,在凝胶电泳中显示为DNA梯度,这是细胞凋亡后期的确切证据和检测指标。本研究结果表明,经加热处理后Lovo细胞DNA裂解为阶梯状片段,并随着作用温度和时间的增加,凋亡、裂解的细胞明显增多,在43℃处理3、4h和44℃处理1、2h组,细胞裂解最为明显。对于每一种肿瘤细胞来说,可能都存在着诱导其凋亡的最佳温度和时间,超过和不足都会导致其热疗效率下降。　　细胞经加热处理后,随着温度2时间的改变,出现程度不等的形态学变化,如细胞的缩小直至变圆脱壁。随着温度2时间的增加,脱壁细胞逐渐增多。44℃3h时,细胞已基本完全脱壁,并可见脱落细胞

　第5期　　朱惠明,等　加热诱导结肠癌细胞Lovo凋亡的研究中有大量的细胞碎片,这可能是加热过度使凋亡细胞迅速崩解的缘故。本实验还通过Hoechst33258染色观察细胞核染色质的变化过程。Hoechst33258是与DNA特异结合的活性染料,其结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A2T碱基区。紫外光激发时可发射明亮的蓝色荧光。观察荧光变化可了解染色质的变化过程:聚集浓缩→裂解为碎块,呈明显的凋

[7]

亡变化过程。流式细胞术检测细胞周期分析显示,加热后不仅G1期前出现凋亡特有的亚二倍体峰,而且细胞周期也发生了变化,即G1期细胞下降,而S期和G2/M期细胞有不同程度的增加,说明加热诱导细胞凋亡具有一定的周期特异性。

参考文献:

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・401・

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(责任编辑:鲁　立;　英文编辑:唐文杰)

(上接第398页)

为78.1%～95.6%,乙酰异烟肼的提取回收率为

83.4%～94.4%。异烟肼和乙酰异烟肼低、中、高3种浓度的日内、日间变异均<10%。结果见表1。

表1　异烟肼和乙酰异烟肼的回收率和精密度试验

Table1　Recoveryandaccuracyofisoniazidandacetylisoniazid

determination

测定项目　　异烟肼　　　药物浓度(mg/L)0.251.997.940.272.148.n提取回收率(%)78.85.95.83.86.94.(x±s)1±0.009±0.0876±0.184±0.00572±0.1±0.23RSD(%)日内2.4.2.2.8.2.1690391083日间2.3.2.3.5.3.947551046015难保证每次样品的水解条件完全相同。故我们推测若控制不好,由此法测得的乙酰异烟肼浓度有可能不够准确。

本研究采用血浆经蛋白沉淀后直接进样的HPLC法,在流动相中加入庚烷磺酸钠,延长异烟肼和乙酰异烟肼的保留时间,对两者同时测定,无需有机溶剂提取,大大简化了测定过程并提高了测定准确性。我们认为,本法完全可用于临床治疗药物检测及药代动力学研究。

参考文献:

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乙酰异烟肼　6666663　讨　　论

由于异烟肼极性很大,在色谱系统中保留时间很短,与血浆中内源性杂质很难分开。国内文献报

[1,4,5]

道测定异烟肼绝大多数采用衍生化方法,将异烟肼与桂皮醛反应生成异烟腙,在340nm波长处测

[6]

定。我们尝试了国外文献报道的方法,但提取回收率一直不稳定,这可能是由于异烟肼和乙酰异烟肼的极性很大,难以找到合适的提取溶剂。

[7]

国外报道测定乙酰异烟肼采用如下方法:乙酰异烟肼与桂皮醛不发生反应,先测定异烟肼的浓度,再将乙酰异烟肼水解生成异烟肼,测定异烟肼总浓度,减去事先测得的异烟肼浓度,即得乙酰异烟肼的浓度。但异烟肼在酸性及加热条件下会降解,很

(责任编辑:鲁　立;　英文编辑:郭联庆)