一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 1047209 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.06.24

(21)申请号 201310711849.5(22)申请日 2013.12.19

(71)申请人普莱柯生物工程股份有限公司

地址471000 河南省洛阳市高新区凌波路5

号(72)发明人张许科 孙进忠 白朝勇(74)专利代理机构北京华夏正合知识产权代理

事务所(普通合伙) 11017

代理人韩登营(51)Int.Cl.

C12R 1/91(2006.01)

C12N 5/10(2006.01)A61K 39/29(2006.01)A61P 31/14(2006.01)G01N 33/569(2006.01)

()发明名称

一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用(57)摘要

本发明提供了一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法，该方法包括：（1）用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养该消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；（2）采用脂质体转染法，将编码hTERT和Marker基因的真核表达质粒导入该原代培养的鸭胚肝细胞；（3）培养该转染的鸭胚肝细胞，用G418筛选该hTERT阳性克隆；（4）培养筛选的该hTERT阳性克隆，连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。该永生化的鸭胚肝细胞形态规则，培养条件简单、容易控制，使用方便，为研究鸭病，特别是研究鸭肝炎病毒提供了很好的载体。

权利要求书1页 说明书6页 附图1页

C N 1 0 4 7 2 6 4 0 9 ACN 1047209 A

权 利 要 求 书

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1.一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法，所述方法包括：（1）用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养所述消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；（2）采用脂质体转染法，将编码hTERT和Marker基因的真核表达质粒导入所述原代培养的鸭胚肝细胞；

（3）培养所述转染的鸭胚肝细胞，用G418筛选所述hTERT阳性克隆；（4）培养筛选的所述hTERT阳性克隆，连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述Marker基因为neo基因。3.根据权利要求1所述方法制备的一种永生化的鸭胚肝细胞系。4.一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，所述方法包括：（1）培养增殖所述永生化的鸭胚肝细胞系；（2）在培养的所述永生化的鸭胚肝细胞系中接种鸭病毒性肝炎病毒，培养增殖所述鸭病毒性肝炎病毒；

（3）收获所述培养的鸭病毒性肝炎病毒，灭活。5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。6.根据权利要求4～5任一项所述方法制备的鸭病毒性肝炎疫苗。7.一种测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价的方法，所述方法包括：（1）将权利要求1所述的鸭肝细胞系接种于细胞瓶中，待长满单层后，传代于96孔板中，每孔1.5～2.0×105个细胞，继续培养；

（2）将鸭病毒性肝炎病毒稀释成100TCID50/1.0ml，与等量的2倍系列稀释的被检卵黄抗体混合，反应；

（3）反应结束后，每一稀释度接种1列（8个孔）长满所述的鸭胚肝细胞的96孔板，置于37℃CO2培养箱中继续培养，同时设阴性和阳性对照；（4）接种后3～4天，记录每个稀释度出现细胞病变（CPE）的孔数，计算所述卵黄抗体的中和效价。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤（2）中所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。

9.根据权利要求3所述永生化的鸭胚肝细胞系在制备鸭病毒性肝炎疫苗、测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价中的应用。

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说 明 书

一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用

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技术领域

[0001]

本发明涉及一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用。

背景技术

鸭肝脏是鸭子的主要消化器官，鸭肝细胞是鸭肝脏的主要功能细胞，许多鸭病原

都能引起鸭肝细胞产生病变，所以建立鸭胚肝细胞系能为研究鸭病提供一种载体，在细胞水平研究鸭病。

[0003] 鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病，鸭病毒性肝炎卵黄抗体可以有效预防和治疗此疾病，目前国内是用鸭胚繁殖鸭病毒性肝炎病毒，然后制成抗原，免疫产蛋鸭，用鸭胚繁殖鸭病毒性肝炎病毒成本高，操作过程繁琐。[0004] 目前测定鸭病毒性肝炎卵黄抗体采用的方法是中和试验，即将卵黄抗体倍比稀释后，用标准抗原中和，然后接种鸭（鸡）胚，计算半数致死量（LD50），该方法存在成本高，误差较大等弊端，不能准确测定鸭病毒性肝炎抗体的水平。所以有人尝试将利用原代鸭肝细胞建立中和试验的方法，如《鸭胚肝细胞培养的研究》（甘肃农业大学学报，1994年02期）《鸭、肝细胞原代培养方法的建立》（天津医科大学学报，1996年02期）公开了鸭胚肝细胞的分离培养方法。但是原代鸭胚肝细胞的分离培养每次必须用到鸭胚，制作程序繁琐，成本高，容易污染，细胞状态不容易控制。此外，且含有杂细胞，批次之间差异大，细胞病变不明显，所以该方法难以推广。

[0002]

发明内容

[0005] 为解决现有技术的不足，本发明采用基因重组技术，将端粒酶逆转录酶基因（hTERT）转染原代鸭胚肝细胞，首次建立制备永生化的鸭胚肝细胞系的方法，制备出永生化的鸭胚肝细胞，且鸭病毒性肝炎病毒可以在细胞上繁殖，有明显病变，用来繁殖的病毒效价高于鸭胚繁殖病毒效价，使用方便，可以用来生产鸭病毒性肝炎抗原。

[0006] 本发明的主要目的在于提供一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法，所述方法包括：（1）用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养所述消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；（2）采用脂质体转染法，将编码hTERT和Marker基因的真核表达质粒导入所述原代培养的鸭胚肝细胞；（3）培养所述转染的鸭胚肝细胞，用G418筛选所述hTERT阳性克隆；（4）培养筛选的所述hTERT阳性克隆，连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系。[0007] 优选地，所述Marker基因为neo基因。[0008] 具体地，所述方法包括：①用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，M199培养基培养48小时后，细胞长满单层，建立鸭胚肝细胞原代培养的方法；[0009] ②采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的鸭胚肝细胞；

[0010]

③细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒48小时，细胞贴壁且状态良好，加

450μg/ml G418筛选，第4天细胞开始死亡，后每3天换一次培养基且加入450μg/ml G418

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说 明 书

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继续筛选，10天后大量细胞空泡化，第18天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，筛选4周后，G418浓度降至100μg/ml维持筛选，待镜下可见较大阳性克隆，使用滤纸片法将阳性克隆消化后，并将其种植于48孔板中，得到抗G418阳性细胞。

[0011] ④将筛选的细胞在CO2培养箱中培养，每隔2～3天传代一次，连续培养超过50代次，即得永生化的细胞系。

[0012] 本发明的另一目的在于提供所述方法制备的一种永生化的鸭胚肝细胞系。[0013] 永生化的鸭胚肝细胞形态规则，培养条件简单、容易控制，使用方便，为研究鸭病，特别是研究鸭肝炎病毒提供了很好的载体。

[0014] 本发明的再一目的在于提供一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，所述方法包括：（1）培养增殖所述永生化的鸭胚肝细胞系；（2）在培养的所述永生化的鸭胚肝细胞系中接种鸭病毒性肝炎病毒，培养增殖所述鸭病毒性肝炎病毒；（3）收获所述培养的鸭病毒性肝炎病毒，灭活。

[0015] 本发明建立的鸭胚肝细胞系接种鸭病毒性肝炎病毒能产生明显病变，可以用来测定鸭病毒性肝炎卵黄抗体，此方法成本低，使用方便，且准确度高，可以大规模的推广。[0016] 优选地，所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。

[0017] 本发明的又一目的在于提供所述方法制备的鸭病毒性肝炎疫苗。

[0018] 本发明的还一目的在于提供一种测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价的方法，所述方法包括：

[0019] （1）将所述的鸭胚肝细胞系接种于细胞瓶中，待长满单层后，传代于96孔板中，每孔1.5～2.0×105个细胞，继续培养；

[0020] （2）将鸭病毒性肝炎病毒稀释成100TCID50/1.0ml，与等量的2倍系列稀释的被检

卵黄抗体混合，反应；[0021] （3）反应结束后，每一稀释度接种1列（8个孔）长满所述的鸭胚肝细胞的96孔板，置于37℃CO2培养箱中继续培养，同时设阴性和阳性对照；[0022] （4）接种后3～4天，记录每个稀释度出现细胞病变（CPE）的孔数，计算所述卵黄抗体的中和效价。[0023] 优选地，步骤（2）中所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。[0024] 目前检验鸭肝炎病毒效价的方法是接种活胚或琼脂扩散法，此方法误差较大，许多机构都在用鸭胚肝细胞研究鸭肝炎效价的测定方法，利用建立的鸭胚肝细胞系极大的方便了鸭肝炎病毒生产、检验等研究。

[0025] 本发明的目的还在于提供所述永生化的鸭胚肝细胞系在制备鸭病毒性肝炎疫苗、测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价中的应用。

[0026] 本发明提供的一种永生化的鸭胚肝细胞系，是以鸭胚肝原代细胞作为宿主细胞，转染pCI-neo-hTERT真核表达载体，经过G418抗性筛选得到的表达人端粒酶逆转录酶且具

保持增高滴度增殖病毒的细胞系。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，

殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。附图说明

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说 明 书

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图1为永生化的鸭胚肝细胞系细胞生长曲线。

[0028] 图2为使用RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT，第1、2、3泳道分别为对转染后第30代和第65代细胞，转染前第2代细胞进行RT-PCR测定基因组中hTERT的存在情况。[0029] 图3为转染后第30代和第65代细胞，转染前第2代细胞细胞内部端粒酶活性的检测。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。[0031] 以下通过对永生化的鸭胚肝细胞系的构建、细胞形态特征、标志物的基因及病毒增殖鉴定，以及在病毒效价测定及应用来做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。[0032] 实施例1鸭胚肝细胞系的构建[0033] 1.pCI-neo-hTERT真核表达系统

[0034] pCI-neo-hTERT可以通过载体连接构建或者商购，本发明具体用到的pCI-neo-hTERT载体购自Addgene公司。[0035] 2.鸭胚肝细胞的分离与培养[0036] 无菌采取15日龄的鸭胚肝脏，剪成约1mm3的组织块，用37℃预热的PBS溶液清洗3次，出去血污。加入适量的EDTA-胰蛋白酶溶液（含胰酶0.05%，含EDTA0.02%，10ml/胚），37℃消化5min，弃去上清。再次加入EDTA-胰蛋白酶溶液，加入磁力搅拌子，放于磁力搅拌器上，120转/min，搅拌消化10min。收集上清液，2～8℃下，600g离心10min，用含适量15%血清的M199培养基重悬，8层纱布过滤后，细胞计数，调整为1.0～1.5×106个/ml，加入25T细胞瓶中，放于CO2培养箱中，37℃培养2～3天，可长成单层。[0037] 3.pCI-neo-hTERT真核表达系统的转染与筛选[0038] 转染前48小时，利用ATV溶液消化原代鸭胚肝细胞传代至第2代，并接种到12孔板中，1.0×106/孔，转染当天达到80～90%细胞汇合度。转染前2小时，将培养基更换成无血清的M199培养基，每孔400μl。用无血清的M199溶液将pCI-neo-hTERT质粒稀释成50μl，0.02μg/μl，轻轻混匀，室温作用5min。将4μl的脂质体（Lipofectamine2000，invitrogen公司）加入46μl的无血清M199培养基中，轻轻混匀，室温作用5min。将混合的质粒与脂质体稀释液混合，轻轻摇匀，室温作用20min。

[0039] 将混合的质粒脂质体溶液逐滴的加入到12孔板中，边加边轻轻混匀，10μl/孔，留2孔做对照。置于37℃、5％CO2培养箱中培养5～6小时，然后更换含15%血清的M199溶液，继续培养。

[0040] 转染后48小时，加入(450μg/ml)G418进行筛选4周，未转染的细胞大量死亡，存活的细胞开始生长，4周后，将G418浓度降为100μg/ml，当有大片阳性细胞克隆时，将单克隆细胞挑选出来传代至48孔板中，加入含100μg/ml的培养基继续培养，每隔2～3天传代一次。培养超过50代后，即为永生化的鸭胚肝细胞系。[0041] 4.永生化的鸭胚肝细胞系的鉴定

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说 明 书

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4.1细胞形态学特征及生长曲线的测定

[0043] 鸭胚肝细胞系与原代分离的细胞相比，细胞为多边形，均匀规则的鹅卵石铺路石状排列，细胞核明显，细胞间存在接触抑制。

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[0044] 将转染后的65代鸭胚肝细胞以1.0×10个细胞/孔接种于24孔培养板，3d换液1次，每天用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，血细胞计数板计数。每个时间点设3个平行孔，每个孔计数3次，取其平均值绘制细胞生长曲线，如图1。图1说明该细胞第2天开始增殖，第3～5天为对数增长期，可见该细胞系有很强的繁殖能力。[0045] 4.2RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT

[0046] （1）根据GenBank中发表的hTERT基因序列，设计出一对引物：上游：5’-TATGCCGTGGTCCAGAAG-3’，下游：5’-TATGCCGTGGTCCAGAAG-3’，扩增片段大小为416bp。[0047] （2）细胞总RNA的提取：取转染前第2代和转染后第30代、65代的鸭胚肝细胞，弃去培养基，PBS洗涤2～3次，加入1mL Trizol混匀，室温静置5min进行裂解，将裂解物转移到离心管，并向离心管中加入0.2mL氯仿，震荡，室温静置10min，4℃，10000r/min离心15min；离心后取上层部分移入另一支离心管，加入0.2mL异丙醇，上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置30min，4℃，10000r/min离心15min；弃上清，加入1mL75％乙醇振荡，7500r/min离心5min；将沉淀室温下放置10min左右自然干燥，用30μL DEPC水重悬，即得细胞总RNA。

[0048] （3）第一链cDNA的合成：反应体系为，5×AMV buffer4.0μl，dNTP5.0μl，随机引物1.0μl，RNA模板1.0μl，RNase Inhibitor0.5μl，反转录酶1.0μl，42℃作用90min。[0049] （4）PCR扩增：扩增程序为94℃5min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，72℃再延伸10min，4℃保存。[0050] （5）凝胶电泳：取得到的PCR产物10μl于0.1％的琼脂糖凝胶中电泳，结果如图2。第1、2泳道为转染后第30代和第65代细胞，第3泳道为转染前第2代细胞，可见转染的hTERT基因存在第30代和第65代的细胞中，而未转染的细胞中没有hTERT基因。[0051] 4.3端粒酶活性检测

[0052] 按照购买Roche公司的TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA试剂盒中的操作说明进行。首先收集转染前第2代和转染后第30代、65代的鸭胚肝细胞各约2.0×105个细胞，用Lysis buffer在冰上裂解30min。12000rpm/min离心20min，取上1μl裂解上清液作为端粒酶模板，按照试剂盒的PCR扩增反应条件进行扩增，阴性对照用RNAase处理。扩增结束后，按ELISA要求进行显色，在450nm和690nm处进行吸光度测定，结果如图3。可见，端粒酶在转染后的第30代和第65代细胞中有非常高的活性，而在转染前的第2代细胞中活性非常低，说明hTERT基因在转染后第30代和第65代的细胞中高效表达，而转染前第2代细胞hTERT基因几乎不表达。

实施例2用鸭胚肝细胞测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价

[00] 1.鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体的制备[0055] 按照常规方法，制备鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体，基本步骤如下：[0056] (1)采用鸭病毒性肝炎DHAV-1型毒株接种10日龄易感鸡胚，然后收获尿囊液，甲醛灭活并制备疫苗；

[0057] (2)使用所述制备的疫苗免疫产蛋鸡，免疫后抽样测定鸡高免蛋黄中抗DHAV-1型

[0053]

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说 明 书

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抗原抗体中和效价≥1∶8192，之后收集所述鸡的高免蛋；[0058] (3)将所述高免蛋蛋壳消毒，收集蛋黄，所述蛋黄加入等体积蒸馏水，搅拌混匀，低温巴氏灭活；酸化蒸馏水法提纯、辛酸法提纯；微滤，超滤。制备三批鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体（1301、1302、1303）

[0059] 2.传统接种鸭胚测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价[0060] 将DHV-1-LY株稀释成每0.1ml含200ELD50，与等量2倍系列稀释的待检抗体混合，37℃作用1小时，期间摇晃数次。每个稀释度接种5枚10日龄易感鸭胚，每胚0.2ml，另设病毒液与等量灭菌PBS混合的病毒对照组和PBS空白对照组各5枚，置37℃培养168小时，记录48～168小时的鸭胚死亡数，判定结果。空白对照组应全部健活，病毒对照组应全部死亡。

[0061] 能使50%鸡（鸭）胚不发生死亡的最高抗体稀释倍数即为该抗体的中和效价。[0062] 3.接种鸭胚肝细胞测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价[0063] （1）将建立的鸭肝细胞系接种于25T细胞瓶中，待长满单层后，传代于96孔板中，每孔1.5～2.0×105个细胞，继续培养。[00] （2）将DHV-1-LY株稀释成100TCID50/1.0ml，与等量的2倍系列稀释的被检卵黄抗体混合，37℃反应60min。[0065] （3）反应结束后，每一稀释度接种1列（8个孔）长满鸭肝细胞的96孔板，置于37℃CO2培养箱中继续培养，设阴性和阳性对照。[0066] （4）接种后3～4天，记录每个稀释度出现细胞病变（CPE）的孔数，按Reed Muench法计算卵黄抗体的中和效价。

[0067] 4.接种鸭胚和接种鸭胚肝细胞测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价的比较[0068] 将制备的三批鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体（1301、1302、1303），参考《中国兽药典（三）》附录中和试验的方法，将中和后的鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体分别接种鸭胚和鸭胚肝细胞，均设3组平行对照，结果如表1。因为建立的鸭胚肝细胞系形态和活力稳定，且对鸭病毒性肝炎十分敏感，病变典型，所以用鸭胚肝细胞测定的卵黄抗体效价，比用鸭胚测定的卵黄抗体效价高，并且稳定，误差小。[0069] 表1

[0070]

实施例3鸭病毒性肝炎疫苗的制备

[0072] 将转染的鸭胚肝细胞长满单层后，弃掉培养基，接种用灭菌PBS溶液作1∶100稀释的DHV-1-LY株病毒液，37℃吸附1h后，弃掉病毒液，加入10%的M199培养基，放入CO2培养箱中，37℃继续培养，同时设对照组。接毒后每天观察细胞病变，与对照组相比，接毒后24小时，细胞出现CPE，72h病变明显，病变细胞出现空泡，有拉网现象，部分细胞裂解。收毒，

[0071]

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测毒价。

将鸭肝炎病毒DHV-1-LY株毒种用灭菌PBS溶液作1∶100稀释，经尿囊腔接种

10～12日龄易感鸭胚，每胚0.2ml。置37℃继续孵育，弃去48小时内的死胚，收获48～96小时死亡鸭胚，置2～8℃冷却12～24小时。将检验无菌的鸭胚液混合后，定量分装，冷冻保存，测毒价。

5.21

[0074] 结果传统接种鸭胚制备的病毒液病毒滴度为10TCID50/ml，而接种鸭胚肝细胞的病毒滴度为106.43TCID50/ml，可见鸭病毒性肝炎I型病毒DHV-1-LY可以在鸭胚肝细胞上大量增殖，且优于传统接种鸭胚的方法。

[0075] 将上述两种方法制备的病毒液分别以0.2%甲醛溶液灭活后，与矿物油佐剂乳化配制鸭肝炎I型病毒灭活疫苗。使用雏鸭测定，疫苗最小免疫剂量为0.15ml，确定使用剂量为0.3ml/羽。单剂量、单剂量重复和超剂量安全试验结果为：细胞制备的疫苗不引起雏鸭的全身不良反应和明显的局部反应，且能诱导产生90%以上保护；鸭胚制备的疫苗1/10-2/10不同程度的局部反应，注射部位易形成肿块，能诱导产生90%以上保护。两种疫苗分别一次免疫3日龄雏鸭后，不同时间诱导产生的HI抗体滴度（GMT）分别是：细胞苗7天为1:256，14天为1:1024，21天为1:1151；鸭胚苗7天为1:227，14天为1:6，21天为1:1024；抗体水平均较高，免后14天使用强毒株LY株攻毒，均可提供≥90%的保护。[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0073]

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说 明 书 附 图

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图2

图3

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