试验研究 ２０１５年第４５卷・第Ｏ７期 ｓｈｌ Ｊｌ 固 猪蓝耳病毒衣壳Ｎ蛋白的原核诱导表达及鉴定 张 蕾０ ，魏彦明 ，韦凤翔 ， （１．甘肃农业大学，甘肃兰州７３００７３；２．甘肃省白银市白银区兽医局，甘肃白银７３０９００） 摘 要：本实验首先双酶切含有Ｈｉｎｄ３和ＮｃｏＩ酶切位点的ＰＲＲＳＶ目的基因的质粒ｐＵＣ一５７一ｐＲＲｓＶ Ｎ ｇｅｎｅ，利用 酶切的目的基因与表达载体ｐＥＴ－２８ａ，，构建重组表达载体ｐＥＴ一２８ａ—ＰＲＲＳＶ Ｎ ｇｅｎｅ，为实现目的蛋白原核表达，建立 针对该病的快速、有效的检测方法研发安全高效的疫苗等针对猪群ＰＲＲＳＶ进行后续研究的奠定基础和前提条件。 关键词：猪蓝耳病；Ｎ蛋白；诱导表达；鉴定 中图分类号：￥８５５．３文献标识码：Ａ文章编号：１００６－７９９Ｘ（２０１５）０５—００２７—０２ 猪繁殖与呼吸综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ １．１主要试验材料及仪器设备 胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司； Ａｘｙｐｒｅｐ质粒ＤＮＡ小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭 Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）是由猪繁殖与呼吸综合征 病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｍ， ＰＲＲＳＶ）引起的猪的繁殖与呼吸系统疾病。该病所表 现出的病理特征为：妊娠母猪的流产、产死胎、弱胎、 木乃伊胎等，怀孕母猪表现出繁殖障碍，仔猪则以呼 州）有限公司；琼脂糖凝胶；０．５ ｇ／ｍＬ ＥＢ；ＴＧＬ一１６Ｍ台 式高速冷冻离心机；ＤＹＹ一１２型电泳仪；紫外凝胶成像 系统；凝胶加样缓冲液（６×）、琼脂糖１．５ ｍｏｌ／Ｌ，Ｔｒｉｓ ＨＣ１， ｐＨ８．８、２０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣ１．ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、３０％Ａｃｒｙ— 吸道症状较为常见，该病对猪的致死率较高ｌｌ１。 近年来，随着养猪业的发展，ＰＲＲＳＶ给世界各国 养猪业造成了重大的经济损失。有文献报道，在１９９１ 年，荷兰兽医研究所首次用猪肺泡巨噬细胞 （ＰＡＭ）分离培养获得病原猪繁殖与呼吸综合征病毒， 并定名为Ｌｅｌｙｓｔｅｄ病毒（Ｌｖ）回。随后美国研究者利用他 ｌａｍｉｄｅ ００％）、ＰＲＲＳＶ ｏｆｆ７基因片段、感受态细胞 ｔｒａｎｓ５ 、大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）等均由中国农业科学院兰 州兽研所提供。 １．２试验方法 １．２．１构建重组表达载体 １．２．２摇菌用接种环蘸取含有目的基因的细菌穿刺 们已建立的细胞系分离到的病毒取得了类似的结果， 他们称该病毒为ＶＲ一２３３２。将各种不同病毒株统称为 猪繁殖与呼吸综合征病毒，根据感染时引起猪的严重 程度，国际兽疫局ＯＩＥ将该病定为乙类传染病。因此 对猪繁殖与呼吸综合征病的研究具有重要的意义，目 前，已引起世界各国的广泛关注。 我国正处于养猪业蓬勃发展的时代，猪繁殖与呼 吸综合征流行面积逐步扩大和蔓延使我国养猪业处 液，在ＬＢ培养基中３７＇ｔ２，摇床２２０ ｒｐｍ／ｍｉｎ摇菌１２ ｈ 取菌液备用。 １．２＿３质粒ｐＵＣ一５７一ＰＲＲＳＶ Ｎ ｇｅｎｅ的提取 按照 Ａｘｙｐｒｅｐ质粒ＤＮＡ小量试剂盒操作步骤进行操作。 １．２．４酶切（ＮｃｏＩ ＨｉｎｄｌｌＩ）构建１００ Ｉ，ｘ Ｌ酶切体系，按 如下剂量加样，体系如下： ＰＩ ＪＣ５７一一一一一一一一ＰＲＲＳＶ 于非常严峻的形势。如何使用有效、实用的手段对本 病进行及时检测，进而采取相应措施进行防制是本病 研究的重点之一。因此，本研究通过对ＰＲＲＳＶ的Ｎ蛋 １Ｏ×Ｋ ｂｕｆｆｅｒ ＢＳＡ ＮｃｏＩ 白进行重组表达载体的构建研究，为进一步建立分子 生物学诊断方法奠定基础。 ＨｉｎｄⅢ Ｈ２０ １材料与方法 质粒 作者简介：张蕾（１９９２一），女，甘肃白银人，研究生，主要从事猪蓝耳病病毒蛋白表达方面的研究。 通讯作者：魏彦明’ ２７ ｌ
